Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 43
Текст из файла (страница 43)
Кошапоя М. А., С. А. Бсогег, Л. Л. С!аге. 1992. Роге)йп 8епе ехргсвгйоп ш усаьг: а геч)ечч. Усах! 8: 423 — 488. Уогха 1 . А., Г . %!!!шаг, )). К. Н)88)пя, Т. Л. Ригсей, М. Вегйяе)4, ).. А. Сой)пя-Кас)е, Е. К. ),вагой)е, Л. Р. Ноей)ег. !996. Ргог)ис))оп оГ а гссогпЬ)- пап) Ьоч)пс сп)сгоРйпаяе са)а!у))с ьиЬипй ш 1Ьс гпебйу!о!гор)йс усах), Р(с(г(а рая(ог(к В(о/ 7ес(гпо(о8у 14: 77 — 81. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Почему лля получения бслков, использую- шихся в мслицинс, лучшс применять эукариотичсскис, а нс прокариотичсские систсмы? 2.
Какис досюинства и нсдостатки имегот различныс типы дрожжевых векторов, предназначенных для получения данного рекомбинантного продукта? 3. Опишите основные свойства интегративной векторной систсмы Р. рав(ггг(я. обладаюгыей высоким уровнсм зкспрсссии. 4. Что такое бакуловирусы? Опишите исходную систему экспрессии на основе бакуловирусов и ее послсдующис модификации. 5. Что такое бакмида? Для чего ее используют? Получение рекомбииантиых белков с помощью эукариогических систем 157 6. Что такое аффинная мстка7 Для чего ее используют'? 7.
Опишите основные свойства внехромосомного экспрессирующего вектора млекопитающих. в. Опишите как минимум две селективные системы, использующиеся в случае экспрессирующих векторов млекопитающих. 9. Опишите разные подходы к созданию систем синтеза двух рекомбинантных белков в одной клетке млекопитающего. 10. Какими критериями руководствуюгсн при выборе системы экспрессии генов гетеролопачных белков (дрожжи, система экспрессии на основе бакуловирусов, клетки млскопита1ощих)? ГЛАВА 8 Направленный мугагенез и генная инженерия белков Технология рскомбинантных ДНК позволяет выделять гены любых белков, существующих в природе, экспрессировать их в специфическом хозяйском организме и получать чистые белковые продукты.
Однако физические и химические свойства таких «природных» белков часто не удовлетворяют условиям, обеспечивающим возможность их промышленного применения. Иногда для получения белков, обладающих нужными свойствами, в качестве источника соответствующих генов используют организмы, рас>ущие в необычных, зачастую экстремальных условиях. Например, для синтеза и-амилазы, не утрачивающей своей активности при высокой температуре, выделили се ген из ВасШиз згеагог)>еппорЫлз — бактерии, естественной средой обитания которой являются горячие источники с температурой воды 90 "С. Полученная таким образом а-амилаза оставалась активной при температурах, при которых осуществлшот промышленное произволе.гво этилового спирта нз крахмала. Для получения белков с заранее заданными свойсгвами можно использовать также мутантные формы генов.
Однако число мутантных белков, образуюп>ихся в результате замены отлельных пуклеотидов в структурном гене с помощью обычного мутагенеза, чрезвычайно велико. Мутагепсз с последующим отбором редко приводит к существе>~ному улучгнсни>о свойств исходного белка, поскош ку большинство амипокислотных замен сопровождается снижением активности фермента.
Для создания белков со специфическими свойствами можно использовать другой подход, основанный на внесении изменений в кодирующис их клонированныс гены. Зго позволяет получать белки с другими, чем у их аналогов, свойствами. ° Изменив константу Михаэлиса (Км), которая харакге)>изует г>рочность связывания субстрага с ферментом, и максимальную скорость (И,„) превращения субстрата в продукт при определенных условиях, можно повысить общую каталитическую эффективность (К „/К ) реакции; И „„равна полному количеству фермента (Ь'„), умноженную на каталнчсскук> константу (1,.м).
° Повысив стабильность белка в широком диапазоне температур или рН, можно использовать его в условиях, при которых исходный белок инактивируется. ° Создав белки, способные функционировать в безводных растворителях, можно осушсствлять каталитические реакции в нсфизиологических условиях. ° Изменив белок таким образом, чтобы он мог работать без кофактора, можно использовать его в некоторых непрерывных промьпплснных процессах. Изменив активный центр фермента, можно повысить его специфичность и уменьшить число нежелательных побочных реакций.
° Повысив устойчивость белка к клсгочным протсазам, можно упростить процедуру его очистки и повысить выход продукта. ° Изменив аллостсрическую регуляцию фермента, можно уменьшить степень его ингибирования метаболитом по типу отрицательной обратной связи и увеличить выход продукта Направленный мутагенез: метх>дика Получить новый белок с зарансс заданными свойствами — непростая задача, но вполне реально изменить свойства уже существующего белка.
Изменения можно вносить в сам белок или в его Направленный мутагенез и генная инженерия белков 159 ген. Однако химическая модификация белков редко бывает строго специфичной и ее необходимо осуществлять заново для каждого белкового препарата, гюзтому лучше вносить изменения н его клонированный ген. К сожалению, не всегда бывает известно, какую именно аминокислоту или последовательность аминокислот нужно изменить, побы получить белок с нужными Физическими, кинетическими или химическими свойспгами. Может случиться, что изменения должны затрагивать два или более аминокислотных остатка, расположенных далеко друг от друга в полинсптидной цепи, но сближающихся в результате укладки белковой молекулы.
Есгь надежда, что уже в нсдюгеком будущем с помощью компьютеров удастся предсказывать свойства того или иногоо белка, исходя из данных о его аминокислотной последовательности. Это значительно упростит процедуру создания нужных белков. Введение новой генетической информации в клонированные гены сейчас не составляет особого труда, однако чтобы определить, обладает ли искомый белок нужными свойствами, необходимо проанализировать множестно белковых продуктов. Внесение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящих к определенным изменениям в аминокислотных последовательностях, называется направленным мутагенезом.
Идентификация аминокислот, замена которых даст желаемый результат, облегчается, если детально известна просгранственная структура белка (ее устанавливают с помощью рентгепоструктурного анализа или другил аналитических методов). Однако для большинства белков такие данные отсутствуют, позтому направленный мугагенез — зто в значительной мере змпиричсская процедура, основанная на методе проб и ошибок. Каждый белок, кодирусмыи мутантным геном, нужно протестировать и убедиться в том, что мутация дала желаемый' эффект. Для направленного мутагснеза клонированных генов используют разные экспериментальные подходы. В одних случаях вносят изменения в специфические сайты клонированного гена, в других случайным образом изменяют короткий фрагмент клонированного гена и среди образующихся мутантных белков выбирают один, обладающий необходимой активностью.
Олигонуклеатис)-нагграаленный лсутагенез е использованием ДНК с(гага М13 Олигонуклсотид-направленный (сайт-специфический) мутагенез — это один из наиболес простых методов внесения точковых мутаций в клонированный ген (рис. 8.1). Для его осуществления необходимо знать: !) точную нуклсотидную последонательность той области ДНК, которая соответствует мРНК-кодону, подлежащему изменению; 2) характер аминокислотных замен. Обычно встраивают ген-мишень в днухцспочечную форму вектора на основе бактериофага М(3. Сначала выделяют одноцепочечную форму вектора (плюс-пень М13) и смешивают се с синтетическим олигонуклсотидом, в то шости комплемснтарным — за исключением одного нуклеотида — нужному сегменту клонированного гена.
Этот отличающийся (т. е. нсспаривающийся) нуклеотид соответствуес тому нукзеотиду кодона мРНК, который необходимо изменить. В случае, представленном на рнс. 8.1, триплет АТТ, соответствующий изолсйпиновому колону ЛЬО, нужно заменить на триплст СТТ, соответствующий лейциновому кодону С(Л3. Олигонуклеотид будет гибридизоваться с комплсментарным участком клонированного гена в том случае, если: !) он добавлен в коли гсстве, во много раз превышающем количество ДНК М13; 2) неспаривающийся нуклеотид нахолится примерно посередине олигонуклеотида; 3) отжиг проводят при низкой температуре и высокой ионной силе.
3'-конев спарившегося олигонуклсотида служит затравкой для инициации синтеза ДНК, а интактная цепь ДНК М13 — матрицей. Репликация осуществляется с помощью фрагмента Кленова ДНК-цолимеразы 1 Езс)гегсссгга сай при наличии н среде четырех дсзоксирибонуклсознатрифосфатон, а присоединение последнего нуклеотида синтезированной цепи к 5'-концу загранки обеспечивает ДНК-лигаза фага Т4.
Однако !и л йго синтез ДНК редко идет до конца, и часгпчно двухцепочечные молекулы приходится отделять от нормальных цснтрифугированием в градиенте сахарозы. Полностью двухцспочечными молекулами ДНК Фага М13, содержащими, однако, нскомплементарныс нуклеотиды, трансформируют клетки Е. со!г, В последних образуются фаговые ! 60 ГЛАВА 8 Пяюе-цепьДНК М13 3'ОН УР Олнгонуклеотал Неенареннмй нуклеотил | Фрагмент Кленова, ОЫТР Синтезированная цепь | ДНК-лнгаза Т4 | Транеформацня Е.Сод | Образование бляшек Плюс-цеяьДНК М13 частицы, что в конечном счете приводит к лизису клеток и образованию бляшек.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
