Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 41
Текст из файла (страница 41)
150 ГЛАВА 7 Р Рс Аюр' лл™ Рис. 7.13. Обобщенная схема зкспрессирующега вектора млекопитающих. !1олилинкер (ПЛ) и селективный маркер (СМ) находятся под контролем зукариотического промотора (Р) и сигнала полиаденилироваиия (Ра). Репликация вектора в Е. ссп и в клетках млекопитающих обеспечивается сайтами ИпяцяацИИ рЕИЛИКацИИ Охяе И ОГГюг СООтВЕтСтВЕННО Для отбора трансформированных клеток Е. сон используе~ел ген устойчивости к ампициллину (Атрб Вектор, прелставленный на рис. 7.13, содержит эукариотичсский сайт инициации рспликации вируса животных (например, обезьяньего вируса 40 (БЧ40]).
Промоторы клонированного и селективного маркерного генов, а также их сигналы терминации транскрипции (сигналы полиаденилирования) должны происхолить из клеток эукариот; обычно используют регуляторные последовательности 7(НК вирусов животных (например, цитомеголовируса человека, ВЧ40 или НВЧ) или генов млекопитакццих (например, гена р-актина, металлотионеина, тимидинкиназы или бычьего гормона роста). При этом более предпочтительны сильные промоторы н эффективные сигнш1ы полиадепилирования. Последовательности, необхолимые для отбора и амплификации экспрессирующего вектора млекопитающих в Е. со)1, происходят из стандартного клонирующего вектора Е.
сой (например, плазмилы рВц322). Селективные ларкерные гены Для отбора трансфицированных клеток млекопитающих часто используют бактсриальный ген (чео', кодиру|ощий неомицинфосфотрансферазу. В этой системе применяется токсичное соединение генетицин (С1-418), блокирующее трансляцию в цетрансфицированных клетках млекопитаюп1их. При этом в трансфицирован- ных клетках Сз-418 фосфорилируется неомицинфосфотрансферазой и инактивируется.
Следовательно, выживают и пролиферируют только клетки, синтезирующие пролукт гена Гхео'. Другая система отбора трансфицированных клеток млекопитающих основана на использовании гена, кодирующего фермент дигидрофолатредуктазу (1)НРВ). В этой системе используют клетки с дефектным геном 77Нгй, т. е. клетки, в которыхфункциональная 1)НРВне синтезируется. После трансфекции (7НГК -клеток экспрессирующим вектором млекопитающих с функционирующим ШИ71-геном в среду добавляют метотрексат. Не трансфицированные клетки не растут в его присутствии, а клетки, синтезирующие дигидрофолатредуктазу, выживают. После предварительного отбора клеток с 7)НЕ)1-геном концентрацию метотрсксата в среде увеличивают и отбирают клетки с большим числом копий вектора, синтезирующие в большом количестве рекомбинантный белок.
Разработаны и другие схемы отбора с даминантным маркером, например с использованием фермента глутаминсинтетазы (С8), обеспечивающеи устойчивость к цитотоксическому действи|о метионинсулы)>оксимина. В этой системе применяется вектор„несущий б5-ген. Его вводят в культуру клеток млекопитающих и лля отбора клеток, несущих большое количество копий вектора, повышают концентрацию метионинсульфоксимина в среде. При этом в хозяйских клетках тоже должна присутствовать С)8, поскольку только множествегшыс копии 05-гена могут обеспечивать устойчивость к метионинсульфоксимину. Такая схема обладает определенными преимуществами перед описанной выше.
В экспрессирующие векторы млекопитающих уже встроены гены самых разных белков и осуществлена их экспрессия в хозяйских клетках. Иногда выход продукта увеличивался, если между промотором и клопированным геном встраивали иптрон. Механизм этого феномена неизвестен. Возможно, первичный транскрипт кланированного гена содержит скрытые сайты сплайсинга, по которым вырезается часть кодиру|ошей области клонированного гена, а при наличии дополнительного интрона сплайсинг по ним происходит с меньшей вероятностью. Получение рекомбинантных белков с помощью зукаригпнческия сисгеяя !51 Экспрессия двух кланираванных генов в одной клетке млекопитающих сна ря РЛ Первичный тряпскрипт 1г РНК Спяяйсирояяяняя мРНК | Трансляция Ля~иярофояатрелуктяяя Белок а Рис. 7.
14. Коордиянрованная экспрессия генов днгидробюлатредуктазы (0Н ГК) и рекомбинантного белка. Ген РНГЙ встроен между донорным и акцепторным сайтамн сплайсинга интроиа (точки), перед геном-ми~пенью (ген а). И ген РОГЙ, и клонированный ген находятся под контролем одного зукаристического промотора (р) и имеют общий сигнал цолиаленияирояания (ра). РНГК транслируется с неснлайсированного (первичного) транскрипта, а гетерологвчный белок (белок а) — с транскрирла, подвергшегося процессннгу (сплайсннгу). Высокий уровень экспрессии клонированного гена достигался при ее координации с экспрессией селективного маркерного гена.
Для этого, например, ген 01(ГЙ встраивали поблизости от клонированного гена, так чтобы оба гена находились пол контролем одного промотора и имели общий сигнал полиаденилирования, а ген 1)г(гй был фланкирован сайтами сплайсинга интрона. Е)НГК и рекомбинантный белок транслировались с первичного транскринта и сплайсированной мРНК соответственно (рис. 7.14). Некотор)де ценные в коммерческом отношении белки в активной форме состоят из разных полипептидных цепей. Например, тиреотропный гормон человека — это гетеродимер, а гемоглобин — тетрамер, состояший из двух субьединиц, по две копии каждая (гхзр ).
Чтобы получить активный мультимерный белок, можно попытаться клонировать ген или кДНК каждой из субьединиц, синтезировать и очистить 152 ГЛАВА 7 Л СМ2 ра Агар" Лаь аас р 1ен (3 ра рнк Субьелнннцы а ф Функцнональныа белок Рвс. 7.15. Двухвскторная система экспрессии. Клонированные гевгы (ц и (3) кодируют субъединицы димерного белка (и()). После одновременной трансфекции клетки двумя плазмидами в ней синтезирукггся обе субъединицы и собирается функциональный днмерный белок. Оба вектора несут сайты инициации рспликации, функционирующие в Е. сап(еле) и в клетках млекопитакяцнх (агг"""); маркерный гоп (Азпр') лля отбора трансформированных клеток Е.
сей; эукаристический промотор (р) и сипгал полиаденилирования (да), которые регулируют экспрессию селективного маркерного гена (СМ) и каждого из клонированнъ~х генов. субъединицы, а затем смешать их в пробирке. Однако таким образом удается получить лишь немногие мультимерные белки, поскольку ш т)гго правильная укладка полипептидных цепей осуществляется редко. Сборка же димерных и тетрамерных белков ш у)уо протекает весьма эффективно. Поэтому были разработаны стратегии синтеза двух разных рекомбинантных белков в одной клетке.
Для этого хозяйские клетки одновременно трансфицировали двумя экспрессирующими векторами млекопитающих, каждый из кото- рых нес ген или кДНК одной из субъединиц и разные гены селективных маркеров (рис. 7.15). Трансфицированньге клетки подвергали двойному отбору, соответственно и выжившие клетки несли оба вектора. Системы с двумя векторами успешно использовались для синтеза аутентичных димерных и тетрамерных рекомбинантных белков. К сожалению, дважды трансфицированные клетки часто утрачивают один из двух векторов.
Кроме того, число копий каждого из векторов не всегда одинаково, так что одна субъединица может синтезиро- получение рекомбннантных белков с помощью эукариотических систем 153 Авр' см и Р 1«нб Рл РНК ! Субь«лнннпы а ф Функциональный ( ~~ х белок о() ваться в большем количестве, чем другая, и выход конечного продукта может снижаться. Чтобы решить эти проблемы, были сконструированы векторы, содержащие оба клонированных гена. В некоторых случаях они были помещены под контроль независимых промоторов и сигналов полиаденилирования (рис.
7.16). А для того чтобы гарантировать синтез рекомбинантных белков в одинаковом количестве, были созданы так называемые двухцистронные векторы, в которых клонированные гены разделялись сегментом ДНК, содержашим внутренний сайт связывании рибосом. Такие сайты были обнаружены в геномах вирусов млекопитающих; они обеспечивают одновременную трансляцию различных белков с полицистронной мРНК. Транскрипция конструкции «ген — внутренний сайт связывания рибосом —.ген» регулируется Ряс. 7Л6. Экспрессирующий вектор с двумя независимо зранскрибируемыми генами. Клонированные гены (а и 1)) кодируют субъединицы димерного белка (а(3). Каждый ген встроен в вектор как часть оглельноя единицы транскри1шии и находится пол контролем эукариотическош промотора (Р) и сигнала полиаденилирования (Ра).
Каждая субъединица транслируется со своей мРНК, объединяясь, субъединнцы образуют Функциональный димерный белок (гх()). Векторы содержат сайты инициации репликации, Функционирующие в Е, сад (ог(а) и в клетках млекопитающих (сп™); маркерный ген (Агар') лля отбора трансформированных клеток Е. сей; селективный маркерный ген (СМ), находящийся под контролем эухариотическнх промотора (Р) н сигнала полиаденилирования (Ра).
одним промотором и одним сигналом полиаденилирования. Синтезируется один транскрипт с двумя генами, трансляция начинается с 5'-конца мРН К н с внутреннего сайта, в результате синтезируются субъединицы лимерного белка гх и )з (рис. 7.17), Суммируя, можно сказать, что экспрессирующие векторы млекопитающих столь же универсальны и эффективны, как и аекторгл для других эукариотических систем экспрессии, если речь идет о получении аутенти шых рекомбинантных белков для исслеловательских н медицинских целей.
Однако промышленный синтез рекомбинантных белков с использованием модифицированных клеток млекопитающих обхолится слишком дорого. В этом случае предпочтительны менее дорогие системы экспрессии, за исключением тех ситуаций, когда (54 ГЛАВА 7 аутентичности рекомбинантного белка улается достичь только с помощью культуры клеток млекопитающих.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
