Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 44
Текст из файла (страница 44)
Поскольку реш1икация идет по полукоисервативному мехаиизму, половина популяции образующихся фаговых частиц должна содержать ДН К дикого типа, а половина — мутантнузо ДНК со специфической иуклеотилиой заменой. Частицы, содержащие только мутантный ген, идентзифипируют при помощи ДНК-гибридизации в жестких условиях, используя в качестве зонда исходный олигонуклеотид.
Мутантный геи вырезают и встраивают в какой-либо зкспрсссирующий Е. сой-вектор. Мутантный белок синтезируют в Е сой и очи1цают. Рис. ЗЛ. Олигонуклеотия-направленный мутагенез. Олноцепочечную ДНК фага М13 (плюс-цепь), несущую генмишень, отжигают с комплементарным синтетическим олигонуклеотидом, содержащим одно основание, не комплементарное соответствующему Основанию исхОднОЙ ДНК. Олигоиуклеотид служит затравкой для синтеза ДНК, а М!3-вектор с встроенным геном — матрицей.
Репликацию катализирует фрагмент Кленова ДНК-полимеразы 1 Е. Сод. Сицтезироваынукз нолноразмерную цепь замыкает в кольцо ДНК-лииза Т4. Образовавшимися двухцепочечными молекулами трансформируют Е. ео(б Час.п, фаговых частиц содерзкит ДНК ликого типа, часть — мутантную ДНК. На самом деле число фаговых частиц, несущих мутаитную ДНК, оказывается гораздо меньше ожидаемых 50%: лишь 1 — 5% бляшек содержат фаг с мутаитиым генам. Чтобы повысить выход мутантиого фага, метол олигоиуклеотиднаправленного мутагеиеза модифицировали.
Один из подходов состоял во введении М13-вектора, несущего геи, в который необходимо внести мутацию, в штамм Е. со(1', дефектный по двум Ферментам метаболизма ДНК (рис. И.2). Один фермент — это мутантиая форма гШТР- пирофосфатазы (е(иг). Клетки с неактивной г)()ТР-пирофосфатазой характеризуются повышенным содержапием Н!ТР, что приводит к 1!вправленный мугагенез и генная инженерия белков 1б! встраиванию в ДНК при рсгшикации нескольких остатков с)НТР вместо с)ТТР. Второй фермент— зто дефектная урания-)'сгликозилаза (иле).
В отсутствие функциональной урацзп-)л)-гликозилазы схтатки дО РР, случайно встроившисся в ДНК, не могут быль удалены. В одноцепочечной ДНК М13, синтезированной в таких клетках Е: го!с, примерно 1% тимидиновых остатков оказываются замененными уридиновыми. Олигонуклсотид с нскомплсмснтарным основанием отжигают с урацилсодержащсй ДНК М13 и щ уйго достраивают вторую Рсцлмкзтиввая форма ДН К Фага М!3 Плюс-цсцлДНК М! 3 ДН К-лцс аза Т4 Трансфорлслсслся д сод дикого типа ~ Плсоо-цепь М 1 3 Мусзцтцая формса нс леграаируст 1 Трансформасссся штамма / Кзоняромснныя гем К со!с Виголх цепь.
Двухпепочечной ДНК трансформируют штамм Е. со(1, содержащий функциональный ген иле. Активная урацил-)л(-гликозилаза хозяйских клеток удаляв! остатки уриднна из ДНК М13 (рис. 8.2), исходная матричная цепь М13 дсграднруст и далее реплипнруется только мутантная цепь„не солсржасцая гПЛ Р. В рсзулыгас выхол фаговых частиц, несущих м)тантный ген, значительно увеличивается.
Олигонуклеотид-налравленны!) лутагенез с исг3альзаваниел плазмидной ДИК Основной нелостаток олигонуклсотид-направленного мугагснеза с использованием фага М13— болыпое число пропедур. Чтобы выделить мутантную форму нужного гспа„приходится затратить много времени. В качссгве альтернативы системс с использованием фага М13 было разработано множество других подходов, основанных на применении плазмидных ДНК.
Это позволяет обойтись без переноса интересуюшего исследователя гена из плазмиды в фаговую ДНК, а после завершения мутагснеза — обратно в плазмиду. Один из этих подходов включает встраивание ДНК в плазмидный вектор, который несет функпиональный ген устойчивости к тетрациклину и неактивный ген устойчивости к ампипнллину; в середине последнего заменен один нуклеотид (рис. 8.3). Клетки Е. со)! трансформируют вектором, несущим ДНК-мишенгч и двухцепочечную плазмидную ДН К денатурируют щелочью с тем, чтобы получить одноцепочсчные кольцевые молекулы. Денатурированную ДНК отжнгают с тремя разными олигонуклеоти- Рис.
8.2. Повышение выхода мутантною фага М13 путем трансформации штамма Е. сод с)цс сслл. Ген-мишень встраивают в двухцепочечную рспликвгивиую форму ДНК фага М13 в полученными молекулами трансформируют штамм Е. сой с)иг сслк. Мутация с)и! вызывает повышение содержания с)О'!'Р в клетке, что цриволмт к включению в ДНК нескольких осткгкон с)!.!ТР (Щ. а мутация ссцх блокирует их удаление. Двухцепочечиой ДНК М13, содержащей гев-мишень, трансформируют клетки Г.
сод дикою типа. Продукт гена ияя дикого типа (урацлсл-)4-гликозилаза) удаляет все остатки урацила из исходной цепи, и она деградирует. Мутаптная цепь остается интактцой, поскольку опа це содержит остатков урацила. Эш цепь служит мастсицей для репликации ДНК, и в результате доля фаговых частиц, несущих мутанпсмй ген, увеличивается. 1б2 ГЛАВА 3 онную смесь добавляют четыре дезоксирибонуклеозилтрифосфата н ДНК-полнмсразу Т4, функцнонируюшую аналогично фрагменту Кленова ДНК-полимеразы 1 Е.
сой. Гибридизовавшисся олигонуклеотиды служат затравками для синтеза ДНК, а интактная кольцевая молекула !1олиливвер Гев-мишень | Ветрвиввиве гена-мишени в вектор Тег' Геи-мишеиь Тен | Девелурввин Добввтеияе олвгоиуклеотвлов «Мушгениый» ел игоиуклеотил ./ Ашр'-олигонуклеотив Теп-олиговуквеозив Синтез ДН К Трвнш1юрмвция Отбор Мугвитиый геи-мишень Тес Ашв' дами.
Один из них предназначен для внесения изменений в клон ированную ДН К-мнн~ень, второй — для устранения мутации в гене устойчивости к ампицнллн ну, третий — для замены одного нуклеотнда в гене устойчивости к тетрациклнну с тем, чтобы инактивировать этот ген. В реакци- Рис. 8.3. Олигонуклеотид-направленный мутвгенез с использованием плвзмилной ДНК. Ген-мишень встраивают в полилинкер вектора рА1ЛЕК. Плвзмидную ДНК денатурируют в щелочи и отжигают с тремя олигонуклеотидами: «мутагеннымл олигоиуллеотидо, олигонуклеотилом, восстанавливающим устойчивость к ампициллину (Алпр'), и олигонуклеотидом, придающим чувствительность к тетрациклину (Те1л1, Эти олигонуклеотиды служат затравками для синтеза ДНК с помшцью ДНК-полимеразы Т4, а исходная цепь — матрицей.Одноцепочечные разрывь1 в новосинтезировапной цени зашиваются ДНК-лигазой Т4.
Продуктами реакции трансформируют клетки Е. еой и отбирают трансформантов Ашр' и Те1-'. Направленньш мутагепез и генная инженерия белков 163 ДНК вЂ” мазрицсй. Одноцепочсчпые разрывы в новосинтезированной цепи зашиваются с помощью ДНК-лнгазы Т4. По окончании синтеза и лигирования продуктами реакции трансформиру1от клетки Е сой. Трансформантов отбирагот по признаку устойчивости к ампипиллину и чувствительности к тетрациклину. Примерно 90% из них содержат специфическую мутацию в клонированном гене. У остальных трансформантов клопированпый ген пе был изменен либо потому, что олигонуклеотид нс гибридизовался с ним, либо потому, что он вытеснялся в ходе синтеза ДНК. Клетки, несущие мутантный клонированный ген, идентифицируют с помощью 1ибридизации.
Все плазмиды, ппаммы, ферменты, олигонуклсотиды (кроме того, который предназначен для изменения клонированного гена), а также буферы прода1отся в наборе, что облегчает р1аботу. Олигануклеатггд-направленный мутагенез с использованием ПЦР-амплиг!1икации Более простой и быстрый метод получения болыпих количеств мутаптных генов, альтернативный системе с использованисм фага М!3,— сайт-специфичсский мутагенсз в сочетании с полимсразпой цепной реакцией (ПЦР). Один из вариантов этого подхода состоит в следующем.
Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор (рис. 8.4) и помешают препарат в две пробирки. В каждую из них добавляют по два специфических праймера лля ПЦР; ! и 2 в одну пробирку, 3 и 4 — в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплемснтарпы одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 3 комплемснтарцы другому участку, но содержат один некомплсментарный нуклсотид и гибридизуются с разными цепями„ так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов ланной пары.
Положение сайтов гибридизации праймеров ! и 2 в одной пробирке и 3 и 4 — в другой таково, что П ЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объсдинвют и проводш денатурацию, а затем рснатурацию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечныс ДН К из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевых молекул с 11.
двумя однопепочечными разрывами. Зпи разрывы рспарнруются ш что после трансформации Е сод. При репатурации одиночных цепей из одной пробирки образуются линейные молекулы. В клетках Е со)1' стабильно полдержившотся в виде плазмид и наследуются только кольпевыс, а нс линейные молекулы, при этом все они несут сайт-специфическую мутацию. Таким образом, с помощью описанного метода можно вносить точковыс мутации в клонированный ген, при этом отпадает необходимость во встраивании гена в ДН К фага М ! 3, использовании мутантных штаммов Е сод типа дш ице и в переносе мутантного гена из М ! 3-вектора в экспрсссируюший вектор.
Случаиньш мутагенез с использованием «вырожденных» алигануклеатидных праймерав К сожалению, обычно бывасг неизвестно, какую нуклеотидную замену в клонированном гене нужно произвести, чтобы получить белок с нужными свойствами. Поэтому часто приходится изменять один определенный нукчеотндный сайт всеми возможными способами. Например, можно синтезировать олигонуклсотидные праймсры, в одном из сайтов которых находя1- ся разные нуклеотиды.
Такие «вырожденные» олигонуклеотиды обычно получают, добавляя в автоматический синтезатор ДНК на определенном этапе, когда к цепи должен прососдиняться специфический нуклеотид, небольшое количество (до нескольких процентов) трех других нуклсотидов (рис. К5). В результате получается гетерогенный по одному сайту набор олигонуклеотидных праймеров, с помощью которых можно пол)"гить соответствующий набор мутантных генов-мишеней с нуклеотндными заменами в специфическом сайго. Зтот подход имеет два преимущества: 1) не нужно в точности знать, какую роль играет тот нли иной аминокислотный остаток в функционировании белка: 2) поскольку в данном сайте происходят разные аминокислотные замены, могут слу 1айно синтсзироваться белки с разнообразными интересными и полезными свойствами.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
