Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 48
Текст из файла (страница 48)
Чтобы идентифицировать о|О.имальную лля данного сайта аминокислоту, мутантные клоны выращивали в плашках, прогревали при 65 'С в течение 1 ч, охлаждали и измеряли активность субтилизина. Для синтеза активного, не связывающего кальций субтт|лизина пришлось использовать Д Ви!угйу, поскольку лля Е сон такой белок оказался токсичным. Предварительный анализ выявил наличие стабилизирующих мутаций в 7 из 1О исследованных сайтов (табл.
85). Фермент„полученный при их внесении в один ген, обладал кинетическими свойствами, сходными с таковыми исхолного субтилизипа. Кроме того, мутантный субтилизин в отсутствие кальция был почти в 10 раз более стабилен, чем исхолный и, как это нн уливитсльно, примерно на 50% более стабилен, чем исходный фермент в присутствии кальция.
Полученные результаты показываю|, что несмотря на трудоемкость этих экспериментов с помо|цыо генной инженерии можно изменять свойства ферментов, которые зависят от большого числа аминокислотных остатков. Тоб |нцо 85. Влияние случайных ромен ал|инокислотных остатков а опрепеленных учат ках па с | обнльткть суб| нлизина ВРГ ', лишенного кальцийсвазывающего домена" !Иутданаа Увеличение времени полужванн Номер а мипокие.|о|пото тнчатьа Учаетол 2.0 17.0 0 1,2 1,5 1,2 2,6 0 17,0 0 С'|о †уь вет-|Суд 1|е обнар ужо |а Р|о-ьзет Льр-ьЛ1а |.ул -|Лап Л1а — ь|.ен Не обнарул она О|п — ьбуь 1!е обнаружена 2 3 4 5 41 43 73 74 206 214 | -кооеп Омега-петли и-Спираль (5-Слой '| | |н данным ребе ты бттдньььтр е| а|., Выл| Стенда|о |3: 669-673, ! 995.
| З«ьны ьмннонньлтп н п~. О и ньл т н 706 ~м Сут ~ рньнонн ь~ ь Одном ьл~ нд: мсь:у .ппмп Оетыквын Обрь мне|ась лпсульфнлные твндн, пе |Он| белен Оккьннл настолькО с|ьбнльнь м. Изменение специфичности 612ерзиента Олигонуклсотпл-направлс!шый мутагснез ис|юльзуют в основном Лля улучшения уже существукпцих свойств ферме|поп, но, вероятно, с сто помощью можно изменять ферменты таким образом, чтобы они преобреталп лругую специфичность. Например, таким способом на основе относительно неспецифичной знлонуклсазы Го(ь! бь|ЛИ ПОЛуд|СНЫ НОВЫС СайтСНС|знфИЧНЫЕ знцонуклеазы. К настоящему времени илснтифицировано более 2500 ферментов рестрикции-молификации, происхоляп|их из большого числа разных организмов.
Многие из них узнают одну и ту жс нуклеотидную последовательность, так что всего существует около 200 разных рестриктазных сайтов, при этом размер боууьшинства из пих составляет от 4 до 6 и. н, Эн аонуклевзы рестрикции, узнающие такие сайты, расщепляют молекулу ДН К в очень многих местах и используются лля получения больших фрагментов ДНК не столь широко, как эндонуклеазы рестрикции, узнающие нуклеотилцые послслокапсльностп длинной в 8 п. и. нли больше.
Поиск новых энлонуклеаз рестрикции — весьма непростая задача, лля се решения требуется много времени. Вряд ли можно надеяться, что улас|ся найти достаточно много фер- !74 ГЛАВА 53 Нуклеаз)лыл домен |лтг Шее!ь НВ Цинковые пальцы Линк(о ментов, узнав)щих сайты длинной В и. н. и больше, так что Тцгя получения новых рсстриктвз необходимо использовать альтернативные генноинженерный цодхолы. Существует весьма интересный класс бслков, в молскулс которых присутствуют уникальныс структурные помоны, связываклцис атомы Хвгл,— тяк называемые цинковыс пяльцы. Эти белки связываются со специфической нуклсогидной ИОслспОВвтсг|ЬНОсть!О„встряиВяясь с|3Оим схсциральным участком в большую бороздку двойной спирали. Так, белок Ул(2бй из клеток мышей солсржит три цинковых пальца, каждый из которых взаимопсйствуст с оцрслслсннылл колоном ДНК.
Поскольку эти нвльцы связывяются сДНК нсзависимодруготлруга, их можно объединить в составе одного псптипа таким образом, стобы связыввпис происходило с определенным сайтом. Это позволяет создавать нуклевзы, рясщсцляющис ДНК в уникальных сайтах, объединив нуклсотипныс послсповатсльности, копирующие цицковыс пальцы, с частью геня нсспсцифичной нуклсазы ГОИ бактерии Г)ага()аггее!!()п а)(вана)(аггел) Чтобы проверить реальность этого прслположсния, был созпян химерный ген, копирующий участок из шести остатков гистидинв ня )Ч-конце белковой молекулы лля упрощения очистки рскомби!лв!лт!лого белка, три цинксяль|х пальца, липкср (Сйулбсг)3 пля прнпа|ия гибкости рскомбинвнтнои молекуле, а также сопсржвщий часть гена нуклсазы ГОИ (рис.
8.9). После очистки рскомбинвнтного белка )Ч-концевые остатки гистидипа были удалены обрвботкой тромбином. Бактерии, синтезирующие энлонуклсязы рсстриьции,:3йщи1цвют собстВснную ДНК От расщепления с помощью ферментов, мстилируюп|их тс участки молекулы, с которыми связывается соотвстствукицая энпонуклсвзя рсстр|лкции. Однако гоном клетки-хозяина нс защи|цсн от рскомбинвнзной рсстриктазы ГОИ„ и чтобы предотвратить и!бсль растущих клеток, синтсз гибрилного фермента подавляли, поместив сс ген пол контроль системы экспрессии ба«тсриофага Т7.
Ряс. (3,9. 1'енноинжснерная конструкция, кодирующая рекомбннишн ы й белок лцинковые пальцы — энлонуклеа я! |жсц))лкцни Га|г)к В рсзультяте этих экспериментов были получены лвс рскомбинантныс энлонуклсазы рестрикции ГОИ. Одна из них расщепляла ДНК фага 7, в том сайго, который н ожипался, я вторая— в ожилаемом свйтс и — в меньшей степени — в двух пругих сяйтах. Это нс удивительно, поскольку |цшковыс пальцы распознают в основном два из трех оснований тринлетв. Хотя эти рскомбинантныс ферменты нокя нельзя исцользовать в лаборатории, описанный подход созлания уникальных зндонуклеаз рестрикции представляется весьма перспективным. Повышение стабильнасн!и и специфичности фермента Фермент, называемый яктиватором ткансвого цлазминогснв (|РЛ), — это ссриновяя протеинаЗа, СОС|ОЯ|наЯ ИЗ НЕСКОЛЬКИХ ДОМЕНОВ; СС ИС- пользуют в юшникс лля растворения сгустков крови.
К сожалению, |РЛ быстро выводится из системы кровообращения, поэтому сго приходится Вводит| нутсьл инфузии. Чтобы побиться желаемого тсрапсвти |еского эффекта, необходимо использовать высокис концентрации фермента, а это может привопить к нсспсцифичсскому внутрсннсму кровотечению. Таким образом, было бы весьма жслятсльно получить долгоживущий фсрмснт |РА, облада|оший высокич сропс) вом к фибрину в тромбах и нс вызывающий кровотечения.
Волок с такими свойствами можно получить, внося специфические мутации в гон на)ивцого 1РА. Заменив Т1)г-103 нв Азв, получили фермент, сохра!яюшийся в плазме кролика примерно в 10 раз дольше, чем нат|лвный ввр!лянт. Звмснив яминокислоты 296 — 299 с (.ув-Н(В-АгВ-Агя на Л)В-Л(а-Л1В-Л1а. побились существенного |ювышс|шя сропствв фсрмснн) к фибрину. Заменив Авв-1!7 ня (З!в, получили фермент с твкой жс фибринолигичсской активностью, как у исходного фермента. Внеся эти три мутации в один белок, получили (1)срмснт, Обгипш()|ций Вссми трсм5| с13ОйстВями (тябл.
В.б). Чтобы выяснить, можно ли использовать его вместо нативного 1РЛ, нужно цровссти дополнительные исследования. Направленный мугагенез и генная инженерия белков !75 Таблица 8.6. Стабильность и активность различных мутантпых вариантов фермента !РА'1 ') Вврияш Молификввия(и) Стябильпоечь в плазме Сролство к фибрниу Активность Зффектииветь в п.изме рвстворения сгустков Пп(103)-+Луп !.ув1 (ВАгХАгб(296-299) — «А1вА1лАЬЛ1в тьг(103)-«Аш, ! узНЬАгВА«(296-299)чА)вА!нЛ1вЛ1в тат(103)-«Азп, Азп(!!7)-чИп (.узПВАгаАга(296-299) — «Л) вЛ)в А 1вЛ)в, Азп(! 17) — «Спи П«г(103) — «Азп, (.узН!ьАгаАгб(296-299) — «А)вЛ1вА1вЛ)в, Атп(1! 7) -«(«1п 10 0,05 5,3 3,4 1,2 З,З 034 0,93 0,33 1,0 1,33 ОЛ7 О,ба 0,13 0,13 1,13 0,16 0,06 0.56 1,01 0,65 1,! 7 !.За 0,65 ««(!пленным рябо ы реве е! в!., Ргсс Лед Асад ят яч 90 3670-.3674, «994.
т« Все знеченил норм нровены относительно озгп ветсгвуюших знвчснил лля потопного фсрментк Стабильность я цтвзьге об!лоне времени. нсоболимому лы осветления пзезмы; чем болыпе приве,«синея если нов, тем ы нестеби н««сеть. Сролстпо к фибрнну корре,«ярую с зффектипнгхп «о реетворения с«ус«кое. По си ноюению к еюнвнссли в плезне имеет месю отрицетелыем корреляцнн ЗАКЛЮЧЕНИЕ ЛИТЕРАТУРА АЬегп Т. Л., Л.
1. Сава!, 6. А. Ре(айо, А. М. КйЬапоч. !987. Соп(го! 0101!8отепбс епхупте гйеггпоз(аЬ!!!(у Ьу рго(еш епрлпеепл. Ргос. Жагб Асар!. осб 1(оА 84: б78 — б79. Вгапйе Л., 13. В!Ь01, Л. Г. Напаеп, б. Вог)аоп, М. Т. Напвеп, Я. Наче!ппг), Б. б. Ме(Ьег8, Г. )з(огПа, К. )чогПа, 1.. Впе!, А. В. Вогепвеп, Н. О. чо!8(. 1988.
Мопогпепс !пьц!ша оЬ(а!пес( Свойства любого белка зависят от его конформации, которая в свою очередь определяется аминокислотной последовательностьиу. Некоторые аминокислоты в полнпептидной цепи играют ключевую роль в определении специфичности, термостабильностн и других свойств белка, так что замена единственного нуклеотида в гене, кодируюшем белок, может привести к включению в пего аминокислоты, приводящему к понижению его активности, либо, напротив, к улучшению каких-то его специфических свойств.
С развитием технологии рекомбинантных ДНК появилась возможность производить специфические замены в клонированных генах и получать белки, содержащие нужные аминокислоты в заданных сайтах. Такой подход получил 11азвание направленного мутагенеза. Как правило, интересук~ций исследователя ген клонируют в ДНК фага М13. Одноцепочечную форму ДН К этого фага копируют с использованием олигонуклеотидного праймера, синтезированного таким образом, побы в ген-мишень был встроен определенный нуклеотнд. Затем трансформируют двухцепочечными ДНК М!3 клетки Е.
со(г'. Часть образующихся в клетках фаговых частиц несет ген, содержащий нужную мутацию. Такие частицы идентифицируют, встраивают мутантный ген в экспрессирующий вектор, синтезируют белок и определяют его активность. Вносить изменения в клонированные гены можно также с помощью плазмид или ПЦР. Обычно заранее не известно, какую именно аминокислоту (аминокислотьг) нсобходилю заменить для того, чтобы улучшить то илн иное свойство белка-мишени. Поэтому нрелпочтительно использовать случайный, а не олигонуклеотид-направленный мугагенез. Выбюр аминокислоты, подлежащей замене, как правило, производится с учетом ее роли в функционировании белка.
Данные об этом получают в ходе генетических исследований или методом рептгеноструктурного анализа трехмерной структуры белка. Изменяя специфические сайтьг или целые участки белковой молекулы, можно повысить термостабильность белка, изменить его чувствительность к рН, специфичность, аллостерическую регуляцию, потребность в кофакторе и другие свойства. Так, термостабильность триозофосфатиозомеразы удалось повысить, заменив аминокислоты в двух позициях. Этот подход можно использовать как лля придания новых свойств уже сугцествующим белкам, так и для создания уникальных ферментов. )76 )ЛАВА 8 Ьу рго1е)п еп8)пеег)п8 апд!Ьей шегйса1 'ппрйсагюпгь Аапгге ЗЗЗ: 679-682.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
