Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 51
Текст из файла (страница 51)
Клетки селезенки и слившиеся клетки селезенки -селезенки вообще не растут в культуре, а миеломные клетки НОРКТ и слившиеся ю>етки миеломы — миеломы не ъ>огуг использовать гипоксантин в качестве прелшественника в процессе биосинтеза пуриновых оснований гуанипа и аленина, без которых невозможен си>пез нуклеиновых кислот. Но у них есть др>гой естественный путь синтеза пуринов — при участии Лигидрофолатрецуктазы, поэтом>' в состав срецы и вхоцит аминоптерин, ингибирующий активность этого фермента.
Таким образом, миеломные клетки НСРКТ" н слившиеся клетки миеломы — миеломы не могут синтезировать пурипы в среде ГАТ и погибают. Слившиеся клетки селезенки. -миеломь> растут в среде ГЛТ, поскольку: ! ) клетки селезенки поставляют фупкциональнук> НС>РКТ.
которая может утилизировать экзогенный гипоксантин среды несмотря на блокирование синтеза пури. нов с участием дипщрофолатреяуктазы аминоптерином; 2) клетки миеломы способны активно целиться. Ти милиц необходим для устранения блокирования в синтезе пиримидинов, обусловленного ингибированием лигилрофолатрелуктазы. На !й — )4-е сутки после слияния клецок в среде ГАТ остаются и растут только слившиеся клетки селезенки--миелоь>ь>. Их затем вносят в лунки пластиковых микротитровальных плашек и выращивают на полной культуральнои среде без ГАТ, Иденти!)>и>сацин гибриг)нь>х клеточных линии, секретируеи)их с»ецифические антитела Теперь необходимо илентифицировать гибрилные клетки, вырабатывающие антитела к иммунизирующему антигену.
Для этого обычно проволят скрининг культуральных сред, солержащих секретируемыс антитела. Среду из тех лунок„в которых есть расту>цие клетки, отбирают н переносят в лунки другой микротитровальной плашки, предварительно покрытые слоем молекул антигена-мишени. Если в культ>ральной среде нахояизся антитело (первое антитело), распознающее олин из эпигонов ланного антигена, то оно свяжется с анти>сном и остапе>ся в лунках после их промывания. Затем в лунки добавляют второе антитело, специфичное к мьппнным антителам.
Оно будет присоелин>пься к любому первому антителу, связанному с антигсном. К использусь>ому в иь>ьгун>>Оы анализе втогюму антителу предварительно нрисоелиняют й>ермент> который превращает неокрац>енный субстрат в окрашенное соединение. Изменение цвета солерж>лмо>о олной из лунок говорит о том, что исходная культуральная среда солержала антитсло, специфичное к Ланному антигену (рис. 9.2).
Если же такое антитсло в среде отсутствовало, то второму антителу не с чем будет 186 ГЛАВА 9 мунный ответ (изменение цвета), могут содержать смесь слившихся клеток. Чтобы получить линии, происходящие от одной клетки (клоны), клеточную суспензиго из таких лунок разводят культуральной средой и высевают в другие лун- ДО~~~З1 ДО~~~ 0~~~ Оо~Оо селезенка ы весомы 1 1сдожительный отрицательный связываться и оно смоется при втором промывании.
Субстрат в таких лунках останется неокрашенным. Лунки исходной микротитровадьной плашки, среда из которых дает положительный им- | рост на среде ГАТ ((~:~ (~~) аналвз Г!оложительпый Отдельный' / "гвгг 'ь Огдсльный гибрвдоыный гибридомный Рис. 9.2. Скрининг клеток, вырабатывающих моноклональныс антитела. Выделяют клетки селезенки мьппи, иммунизированной специфическим антигеном, и проводят нх слияние с клгггкамн мнеломы„нс вырабатывающими антитела. Слившиеся клетки отбирают по способности к росту на среде ГАТ (гипоксантин, аминоптерин, ти нилин).
Клетки, вырабатывающие специфические антитела к иммунизирующему антигену (клетки гнбридо1чы), идентифицируют иммунологическими метолами и субкультивируют„чтобы получить отдельные клоны. Из гибридомы, растущей в культуре и секретирующей единственный тип молекул антител, получают монокдональные антитела.
Молекулярная диагностика 187 ПОЛИПНЧТИДНЫЕ ГОРМОНЫ Хорионичеекий гонадотропии Гормон роста Лютеинизирующий гормон Фоллнкулоетимулирующий гормон Тирегаронныи гормон Г!ролзкгин МАРКЕРЫ ОПУХОЛИ Кзнцероэмбрионзльный антител Сиецифи геекий лнтиген цредетзтельн Рецептор интерлейкинз-2 Рецептор фактора роста эпидермиса ПИТОКИНЫ Интерлейкины ! — 8 Козгониеетимулиру!ощии фактор ЛЕКАРСТВЕННЪ|Е ПРН!АРАТЫ Теофиллин Гегггамицин !\иклоенорин РАзличные сОе)1инш!ия Тирокеин Витамин В,з Феррипгн Продукты распада фибринз Тзн-белок ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ Хламидиоз Герцес Краснуха Гепатит В Х!егионеллез СПИД Рис. 9.3.
Использование моноклональных антител для выявления различных соединений и диагностики инфекционных заболеваний. ки. После культивирования полученных клонов среды вновь тестируют, определяя, какая из кчеточных линий (гибрицом) продуцирует моноклональные антитела, распознающие антигон-мишень. В том случае, когда получают более одной специфичной гибридомы, провоцятдальнейшие исследования, позволяющие определить, направлены ли антитела, вырабатываемые разными клонами, против одной и той же анти- генной детерминанты.
Каждый кчон, продуцирующий моноклональное анч итело, можно поддерживать в культуре практически бесконечно. Кроме того, образцы можно заморозить в жилкам азоте и использовать их в дальнейшем как источник клеток. Применение моноклональных антител позволяет существенно повысить специфичность метода ЕЕ1ЬА, поскольку они связываются с од- ним, строго определенным антигенным сайтом. К настоящему времени получен целый ряд моноклональных антител, которые можно использовать лля обнаружения различных соелинений и патогенных микроорганизмов (рис.
9.3). Альтернативой получению моноклональных антител из культуры пчбриЛомнь!х клеток может быть отбор и производство моноклональных антител и их частей (Гу-фрагментов), наг!равленпых против антигена-мишени, с помощью Е сои (см. гл. 10). Системы ДНК-диагностики Информация о всем многообразии свойств организма заключена в его генетическом материале. Так, патогенность бактерий определяется наличием у них специфического гена или набора генов, а наследственное генетическое заболевание возникает в результате повреждения оцрецеленного гена.
Сегмент ДНК, детермнниручощий данный биологический признак, имеет строп! опрецеленную нуклеотидную последовательность и может служить диап!остическим маркером. В основе многих быстрых и належных диагностических методов лежит гибридизация нуклеиновых кислот — спаривание лвух комплементарных сегментов разных молекул ДНК. Процедура в общих чертах состоит в следующем. 1. Фиксация одноцепочечной ДНК-мишени на мембранном фильтре.
2. Нанесение меченой одноцепочечной ДНК- зонпа, которая цри опрелеленных условиях (температуре и ионной силе) спаривается с ДНК-мишенью. 3. Промывание фильтра для уцалсния избытка несвязавшейся меченой ДНК-зонда. 4. Детекция гибридных молекул зонд/мишень. В лиагностических тестах, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот, клин!евыми являются три компонента: ДНК-зонд, ДНК- мишень и метод детекции гибридизационного сигнала.
Система цетекции должна быть в высшей степени специфичной и высокочувствительной. 188 ГЛЛВЛ 9 Гнбридызаь(ионные заиды '!тобы обеспечить алекватность диапюстического теста, гибридизапионпые ДНК- и 1'НК- зонды должны быть высокоспепифичными. Другими словами, необходимо, чтобы зонд гибридизовался только с искомой пуклсотидной последовательностью. Если есть вероятность получения ложноположитсльного (наличие гибридизационного сигнала в отсуштвие последовательности-мишени) или ложноотрицатсльного (отсутствие сигнала прн наличии последовательности-мин!они) результата, то целесообразность применения теста значительно снижается. Специфичность зондов может проявляться на разных уровнях: они могут «различать» два и более вила, отдельные шь альмы в пределах одного вида или разные гены.
В зависимости от ситуации зонды могут быть представлены молекулами ЛИК или !'НК; они могу! быть ллинными (более 100 нуклеотидов) или короткими (монсе 50 нуклсотидов), представлять собой продукт хильичсско! о синтеза, клонированныс интактныс гены или их фрагменты. Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следукяцсм. ЛНК патогенного м икроорпць изма расщепляют с помощью рестрипируюшей энлонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем ььроволят скрининг рскомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и нспатогецного шьаммов. Гс плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся ! олько с ЛНК патогенного штамма, составляют основу вилоспеььифи шых зоилов. 1!осле этого проволят рял лополцитсльцых гибридизации с ДНК, выделсшьыми из различных организмов, пабы улостовсриться, по потенциальныс зонды не лают с ними перекрестной гибридизации.
Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и ьщ смешанных культурах. Весьма желательно, чтобы ДН К-диагностику можно было проводить на исходном материале, без лополнителыюго его культивирования или вьшслсния нуклеиновых кислот, особенно в тех случаях, когда тестируются клинические образцы. Исследователи с успехом проводят гибриди- зацию с ДНК-мишенями, присутствуюьцими в образцах кала, мочи, крови, смывах из зева и в тканях без прелварительной их очистки. Если концентрация последовательности-ми!пени в исследуемом образце слишком лила, ес можно амплифицировать с помоьцью полимеразной цепнои реакции (П ПР). Диагностика малярии В качестве примера использования ЛН К-зоьшов для лиагностики заболеваний можно привести про! !сдуру обнаружения Р1аатооЫыт ~а1сьрагит.
Этот парази.! вызывает малярию, заболевание, у!рожающее примерно трети все!о населения Земли. Оп инфицируст эритроциты и разрушает их, что п)ьиводи! к 1ьазвиьикь лихорадки, а в тяжелых случаях — к поражению мозпц почек и лругих органов. Чтобы выявить источники инфекции, оценить эффективность мер по их ликвидации и обеспечить раншок> диагностику и лечение, необходимы достаточно чувствительные, простые и недорогие методы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
