Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 53
Текст из файла (страница 53)
После ПЦР-амплификации ДНК- миц!ени проводят разделение флуоресцеин-меченного праймера и продуктов амплификации, после чего регистрирукзт включение метки (рис. 9.5). Если ДНК-мишень в образце отсутствует, то не будет образовываться и флуоресцирующий продукт. Один из недавно разработанных нерддиоактивных методов детекции основан на использовании зонда — «молекулярного маяка» (рис. 9.6).
Такой зонд состоит из 25 нуклеотилов. Средние 15 из Рис. 9лй Хемгшюминесцснтный метод обнаружения ДН К- мишени. Б — биотин, Щгй— щелочная фосфатаза. А. Связывание биотинилированного зонда с ДНК-мишенью. Б. Связывание стрентавидина с биотином. л. Связывание биотинилированной в!елочной фосфатазы со стрентавидином.
Г. Образование люминесцирующего продукта под действием щелочной фосфатазы. Молекулярная диагностика 19 ! ЩФ Биотииилированвая шело«ная Фесфазаза О-:— -Ы~ ннх комплементарны ДН К-мишени и не спариваются друг с другом, а 5 концевых нуклеотидов взаимно комплементарны и образуют шпильку. К 5'- концу присоединен флуоресценп!ый хромофор (флуорофор), а к 3'-концу — нефлуоресцснтный хромофор (тушитель), на который передается энергия возбуждения флуорофора. В растворе при комнатной температуре «маяк» имеет такую конфигурацию, при которой флуорофор и тушитель находятся в тесном контакте, и флуоресценция флуорофора тушится.
Когда же 15 средних нуклеотидов зонда плбридизуются с комплементарной последовательностью ДН К- или РНК-мип!ени, происходит пространственное разделение 192 ГЛАВА 9 флуорссцснтшли краситель ДНК сясннс ~ошью хроматографии продую гни няифин«цн» Прая мары флуорссцснция ДНК-минмнь Зонд-«маяк» Гибридизация Фуог1р Тушнжп ь флуорссцснцни Гибрид ДНК-мишснг юнл флуоройюра и тушителя, и зонд испускает свет. Температура реакционной смеси должна быть близка к комнатной, поскольку прн ес повышении ннппька денатурирует, флуорофор и туши- тель расходятся и происходит флуоресцснция.
Необходимо также, чтобы все 15 нуклеотилов зонда были комплсментарны соответствующей последовательности ДНК- или РНК-мишени. Рнс. 9.5. Детекция ПЦР-продуктов с помощью Флуоресцентною краси- теля, присоединенного к праймерам (Р1 и Р2). Геномиая докглгогоскопил Метол геномной лактилоскопии 1ДН К-типирование) часто используется в судебной медицине лля идентификации биологических образцов. С его помощью можно доказать, что подозреваемый действительно совершил преступление, или, напротив, что он невиновен.
Для проведе- Рис. 9.б. Гибридизация зоила — «молекулярного маяка» с ДНК-мшценыо. Олноцепочечная область зоила гибридизустся с комплеменгарной псслелонательностью ДНК-мишени, его «шпилька» разрушается. ФдуороФор и тушитель фауоресценцин перестают кона актировать пру г с другом и наблюлаегся фвуоресценция.
Эго указывает на то, что между зондом и послеловатсльностью-мишенью произошла гибридизация. Из работы Туа81, Кпппсг, Лаг. ВгогесЬло1. 14« ЗОЗ вЂ” З08, 1996, с изменениями. Молекулярная анап»о«тика 193 ния ДН К-типирования сначала берут часть биологического образца (пробу крови, сперму, кусочек кожи, волосы) и определяют, достаточно ли в нем интактной ДНК для последующего анализа.
Затем ДНК подвергают эндонуклеазному расщеплению, полученные фрагменты разделякп в агарозном геле и переносят на найлоновый фильтр. Проводят послеловательную гибридизацию с четырьмя или пятью радиоактивно меченными зондами, каждый из которых распознает определенную последователыюсть ДНК (при этом перед гибридизацией со следующим зондом предыдущий полностью удаляют с мембраны). После каждой гибридизации с помощью радиоавтографии визуализируют полосы, отвечающие продуктам гибридизации зонда с рестрицированной ДНК, и строят «лестницу фрагментов» для всех образцов (рис. 9.7).
Каждый этап (гибридизация и радиоавтография) длится от 1О до !4 сут, так что вся процедура может занять много недель и даже несколько месяцев. В качестве зондов обычно используют минисателлитные ДНК, многократно встречающиеся в геноме человека и состошцие из тандемно повторяющихся участков. Длина повторов варьирует от 9 до 40 и. н., а их число — от 1О до 30; при этом одни и те же минисжгеллитные последовательности у разных индивидов могут иметь разную длину. Эти различия возникают в результате увеличения или уменьшения числа тандемных повторов„по-видимому, в ходе репликации ДНК. Никаких биологи геских последствий такие вариации не имеют, поскольку минисателлитные ДНК не кодируют белков.
Ребенок наследует одну минисателлитную последовательность от одного родителя, а другую — от другого. «ДНК-отпечаток» данного индивида представляет собой набор различающихся по длине фрагментов, соответствующих минисателлитным последовательностям его генома.
Ввгщу большого разнообразия этих повторов вероятность того, что в популяции нарщется два человека с идентичными «ДНК-отпечатками», равна 1О 5 — 10 ". Други лги словами, характер расположен1ля полос минисателлитных ДНК почти столь же индивидуален, как и отпечатки пальцев. Геномную дактилоскопию применяют также при установлении отцовства. Часть полос «ДН К-отпечатка» ребенка должна соответствовать полосам материнского «отпечатка», а часть— отцовского. Если ДНК в ясследуемом образце недостаточно, но она не очень сильно разрушена, можно амплифицировать небольшие участки минисателлитной ДНК с помощью ПНР, а затем провести их секвенирование; этот метод более днк из крови ПОДО1РЕВ«- емого д$!к днк Из КРОВИ Из ПЯтНа КРОВИ поеградавшего на рубашке полозреваемого днк известного размера, г.
п. н. Е:::1З и Е: »Л с .3ю 1:::«:3 Е:::Л Е.~::З Е'."" 3 7 Е::::З б Рис. 9.7. Использование Саузерн-гибридизации дли судебной экспертизы. ДНК. выхоленная нз крови пострадавшего, из пятна крови на рубашке полозреваемого и из е»о крови была обработана одной н той же рестрнцнруюшей энлонуклеизой. «Лестница фрагментов» лля ДИК, выделенной из пятна крови на рубашке. идентична таковой лля ДНК пострадавшего и отличается от «лестницы фрагментов» лля ДИК подозреваемого. !9Л ГЛАВА 9 полученный фрагмент можно вьщелить с помощью гель-электрофореза и визуализировать окрашиванием. Число разных фрагментов ДНК, образующихся при амплификации, зависит от праймера и геномной ДНК. Для одних и тех же праймсра и ДНК-мишени продукты амплификации будут каждый раз одинаковыми, а замена лишь одного нуклеотида в праймере приведет к полной смене набора получаемых фрагментов.
Таким образом, используя один и тот же набор олигонуклеотидных праймеров, можно сравнивать КАРО«ДН К-отпечатки» разных растительных культур, а следовательно, и сами культуры. Для выявления различий между двумя очень близкими сортами или культурами растений часто приходится использовать несколько произвольных праймеров с известной нуклеотидной последовательностьк! (рис. 9.8). Как и все другие молекулярные маркеры, КАРР можно примен!пь для характеристики целых геномов, отдельных хромосом или генов.
По сравнению с другими методами идентификации сложных ДНК метод КАРО обладает следующими преимуществами: 1) для всех видов растений можно использовать один и тот же (универсальный) набор олигонуклеотидных праймеров; 2) не нужно создавать геномные биб- Праймгй Б !!раймей В 11раймер А Культура ! Культура 2 Культура ! Культура 2 Культура ! Куллчтра 2 С:~Л Е:.Л Е:::Л Е:::") Е::Л Е:.""Л чувствителен, чем определение полиморфизма длины тандемных повторов. Использование иолимор4ных ДИК-маркеров Метод чДН К-отпечатковь может оказаться полезным и при установлении различий между растительными культурами. Один из вариантов этою метода основан на использования полилюрфных ДНК-маркеров для амплификации случайных фрагментов (гаврош ап!р11Е!ед ро1упюгрйбс ОНА, КАРО). Для этого берут произвольные праймеры длиной 9 — 1О нуклеотидов, не содержащие палиндромных последовательностей и имеющие ОС- содержание 50 — 80г~о„и добавля!от их по отдельности к препаратам хромосомной ДНК растений.
Каждая ПЦР инициируется одним праймером, который долж~и быть способ~и связыва~ьс~ с обеими цепями ДНК-мишени. Нуклеотидные последовательности всех олигонуклеотидов известны, но какой из них окажется эффективным инициатором ПЦР, неясно.
Если праймер гибридизуется с обеими цепями ДНК-мишени в подходящей ориентации и сайты расположены на расстоянии от 100 до 3000 и. и. друг от друга, то фланкироваиный ими сегмент ДНК будет амплифипирован, а Рис. 9.8. Элсктрофорсз ПЦР-аыплифицированных фрагментов растительной ДНК в полиакриламядном геле с последующим окра!виванием бромистым этилием. Для амплификации фрагментов каждой из двух культур использовали три разных произвольных праймера. В случае праймеров А и В характер распределения волос в полиакриламялном геле для культур 1 и 2 совпадает, сели же используется праймср Б, то положение полос различается. Таким образом, с помощью праймсра Б можно выявлять различия между культурами ! и 2.
Молекулярная диагностика 195 лиотеки, использовать радиоактивные зонды, проводить гибридизацию, т. е. можно ле1ко и быстро охарактеризовать большое количество образцов; 3) процесс можно автоматизировать. Кроме тою, для проведения обычной ПЦР необходимо знать нуклсотидную последовательность искомого гена или его фрагмента — мишени для амплификапии. В случае жс КАРР амгшифицируется любой участок генома, содержащий две комплсментарн»яе праймеру последовательности, которые фланкируют сегмент ДНК длиной от 100 до 3000 и.
и. С помощью метода КАРР удалось отличить друг от друга шесть инбрсдных линий кукурузы и показать, что ПЦР-продук|ы гибридов кукурузы представлякп собой сочетание ПЦР-продуктов родительских ннбредных линий. КАРП-маркеры использовали также для скрининш разных штаммов»рибов Веражрйаепа таси1апз, вызывающих заболевание «черная ножка» у крестоцветных. Было установлено различие между невирулентным (не приводящим к развитню болезни) и вирулент.— ным (вызываюн1им заболевание) штаммами. Молекулярная диагностика генетических заболеваний Диагностика специфических наследственных заболеваний человека на генетическом уровне дает ответ на вопрос, входят ли обследуемые ипливидуумы или их потомки в группу повышенного генетического риска.
ДНК-анализ можно использовать для выявления носителей генов наследственных заболеваний, а также для пренатальной и прссимптомятичсской диагностики серьезных генетических нарушений. Тесты на уровне ДН К позволякзт безошибочно выявлять специфические мутации. Раньше лля этого применялись биохимические методы, основанные на выявлении продукта анализируемого гена. ДНК-тесты не требуют экспрессии мутантного гена для его выявления, что позволяет разработать системы скрининга для всех моногенных заболеваний.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
