Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 57
Текст из файла (страница 57)
Исходя из этого находят кодирующую его нуклеотидную последовательность, синтезируют соответствующий олигонуклеотиц и используют его в качестве гибридизациоииого зонда для вьщеления нужного гена нли кДНК из геиомиых илн кДНК-библиотек. Другой подход состоит в выработке антител к очщцеииому белку и использовании их для скриииига библиотек, в которых происходит экспрессия определен!!ых генов.
Для белков человека, с!игтсзируемых преимуществе! вю в какой-то одной ткани, кДНК-библиотека, полученная иа основе мРНК, выделенной из этой ткани, будет обогащена последователыюстью ДНК-мишени. Например, основным белком, синтезируе- Лдренокортиксзргв ~иый гормон пГАнтигрипсин Бактерицилпыи/повышающий пронипаемосп белок Гемоглобин Гормон роста(сомазстропиц) Инсулин Инсулиновоцсбный фактор роста Интерлейкины Инырфероиы (и, (1, т) Кальцитопип 3!имбютоксип Иеяротропнь|й фактор. вырабатзлваемый в мозге Релаксин Рецептор интерлейквна-! Соматогц~бсрин Соматомсдип С Сыворсточ пый альбуми н Тирегпргшиый гормон Тканевая акппатор гиазминогепа Тромбовитарный фактор роста Урогастрон Урокииаза Факзор, активируюший макрофаги Фактор некроза опухоли Фактор роста нервов Фактор роста эп ндерл!иса Факто1з ЧП! Фактор!Х Факторы роста В-лимфопитов Колониецгимулируюшае 4жкторы Хорионичсский гоиадотропии Эпдорфииы и эиксбалины Эр~пуопоэгин мым клетками островков Лангер!писа поджелудочной железы, является инсулин, и 70% мРНК, выделенных из этих клс!тзк, кодируют именно его.
Однако принцип обогащения кДНК неприменим для тех белков человека, количество которых очень мало или место синтеза которых неизвестно. В этом случае могут понадобиться другие экспериментальные подходы. Интерфероны (ИФ) человека, включанпцис а-, (3- и уинтерфероиы (ИФа, ИФ(3, ИФТ), — зто природные белки, каждый из которых может найти свое терапевтическое применение (табл. 10.3). При выделении их кДНК при!шюсь разработать новый подход, позволяющий преодолеть трудности, связанные с недостаточным содержаии- 206 ГЛАВА 10 Табло!!и 10.2 Некоторые рскомбинантные белки, получившие разрешение Департамента по контролю за качеством пищевых продуктоя, медикаментов и косметических средств (США) на применение для лечения заболснаний челояека Белок Заболеяаиие Мйсх, Вал!от НеаЬЬсаге, Оспебсз 1пзз1гше Гзеплупш ОепспгесЬ ОепепгссЬ Гй ! В1у См гоп Пой папи-1.а КосЬе Всьеппа-Р1опйЬ Лнтигемофильный факз ор ГсмофилияЛ Бошезнь Гоше Гл шло переброзиааы 1ормон роста ДНКаза ! Инсулин Интерлсикинз2 ИФо И Фа Дефипит гормона ргкта у летел Мукоанспилоз Сахарпыи лиабш Рак почки Волссисшя летгкоплакия.
саркома Капшпи Волосисгая лейкоплакия.остроконечная конлилома. саркома Капоши, шпатиты В и С Остроконечная когинлома Репгшиаируюгпнй рассеянный склероз Хронический гранулематоз дефишп гормона роста Острый инфаркт миокарла, острая обширная змбслия лсш шой аршрии Анемия,заболсаания почек ИФп„ ИФВи ИФтл, Соматогропин 2 каневой акзшм гор плазм иногсиа Ьяег1егоп Яс!епсеа Вег!сх 1 аьогзгопса апд Смгоп ОепегиесЬ ЕЬ !лйу ОепепгесЬ лгпьеп апс Оггьо В!о!ась Эризропоэтнн стирование. Разбиение на подгруппы повто- ряли до тех пор, пока не идентифицировали клон, содержащий полноразмерную ИФ- кДНК человека. Гиблици !0ыб Возможное терапевтическое примене- ние некоторых интерферонов человека Изперферои Заболеааиие ! спятит С,аолосисгая лсйкоплакая "з Рак мочеаого пузыря, рак холопы и шеи, злокачес пхл шая ме ганома, множестаснные миеломы, нехол:ккинская лнмфома, рак по гкн, болезнь Крона, ВИЧ-инфекпия СПИД, перяикальная лисплазия, папилломаяируспыс инфекнии, хронический гепатит С, осзрокопсчная канлилома гй, чз р|ь Рассеянный склероз Хронический прогрессирук1ший рассеянный скхероз Рак почки, хронический гранулематоз см соответствующих мРНК и белков.
Процедура въздсления кДНК интерферонов состояла в сле- дующем. !. Из лейкоцитов человека выделили мРНК и фракпионировали се по размерам; провели обратную транскрипцию и встроили в сайт Рай плазмнды рВГс322. 2. Полученным продуктом трансформировали Езелег1слга сирс Образонавшисся 6000 клонов подразделили на 12 групп: по 512 клонов в каждой. Тестирования проводили па группе клонов, что позволило ускорить процесс их идентификации. 3.
Каждую группу клонов гибридизовали с нсочищснныл! препаратом ИФ-МРНК. 4. Из образовавшихся гибридов, содержащих клонированную ДНК и мРНК, ныделили мРНК и провели сс трансляцию н бссклеточной системе синтеза белка. 5. Определили интсрферонную противовирусную активность кажлой смеси, полученной в рсзулщвте трансляции. Группы, проявившие интерфсронную активность, содержали клон с кДНК, гибридизовшейся с ИФ-мРНК. 6. Позитивные группы разбили на 8 подгрупп, содержащих по 64 клона, и вновь провели тс- Если нужно получить большие количества ИФ, соотнетствукнцую кДНК можно субклонировать в экспрессирующем Е. сойквскторе, который позволяет достичь высокого уровня экспрессии. Микробиологическое произволе!во лекарственных средств 207 Первый ген интсрфсрона бьп выделен в начале 80-х и.
С тех пор было обнаружено несколько разных интерфсронов. Как мы уже говорил!!, исходя из химических и биололических свойств всех их можно полраздсли и на три группы: ИФа, ИФ!) и ИФу. ИФа и ИФ)3 сллнтезллрукпся клетками, обработанными препаратами вирусов или вирусной РНК, а ИФу вырабатывается в ответ на действие веществ, стимулирующих рост клеток. ИФа кодируется семейством генов, включающим как минимум !5 нсаллсльных гслюв, в зо время как ИФ)3 и ИФу кодируются одним геном кажлый. Полтины ИФи проявлгнот разную специфичность.
Например, при проверке эффективности ИФа, и ИФа на обработанной вирусом линии клеток быка эти интсрфсроны проявляют сходную противовирусную активность, в случае же обработанных вирусом клеток человека ИФо оказывается в семь раз активнее, чем ИФиг Если противовирусная активность проверяется на клетках мыши, то ИФа оказывается в 30 раз менее эффективным, чем ИФаг Было предпринято несколько попьпок созлать ИФ с комбинированными свойствами, используя тоз факт, *по члены семейства ИФа КЕ2 ! ен ИФа ЕЕЗ лен ИФа, Рис. 10.1.
Структура генов ИФа,, ИФи и четырех гибрвлных генов. Сравнение нуклеотвдных последовательностей генов ИФи н ИФа, обнаруживает наличие у них одинаковых сайтов для рестрнцнрующях зндонуклеаз (ЕЕ!, ЕЕ2, 11ЕЗ). Рестрикция по этим сайтам и лнгнрование полученных фрагллентов приводят к образованию различных гибридных !снов. В нижней части рисунка предсгавлены четыре нз ннх. з з и ль Иин!ер4ероны человека, полученные л!етодолл генной инженерии различаются по степени и специфичности своей противовирусной активности.
Тсоретллчсск!л этого можно достичь, соединив части последовательностей генов разных ИФо.. Зло приведет к образованик! гибридного белка с другими своиствамн, чем у каждого из исходных белков, Сравнение послеловгпсльностей кДНК ИФа, н ИФи, показало, что они содержат одинаковыс сайзы рестрикции в позициях б0„92 и 150. После расщепления обеих кДНК в этих сайтах и последующего лиилрования фрагмснлов было получено несколько гибридных генов !рис. 10.1). Эти гены экспрсссировали в Е. со)л, синтезированные белки очистили и исследовали нх биологические функции.
Проверка защитных свойств гибридных ИФ на культуре клеток млскопизаю!цих показала, по нскоторыс из них проявлнот бблыцук> активность, чем родлиельскис молекулы. Кроме того, многие гибридныс ИФ нндуцпровали образование 2 — 5 -олигоизоадснилазсинтетазы в контрольных клетках. Ззоз фермент участвует в синтезе 2 — 5'-связанных олигонуклеоз илов, которые в свою очсрсль активируют латентную клеточную эндорибонуклсазу, расщспляющую вирусную мРНК. Другис гибридныс ИФ проявляллл большую, чем родительские молекулы, антипролифсративную активность в культурах различных раковых клеток человека. 208 ГЛАВА 10 Гормон раста человека, полученный методом гепнои инженерии Оптимизация генной экспрессии Недостаточно создать новый белок, важно оптимизировать экспрессию ого гсна. Для начала исслсдоватсли опрсдсляют возможность синтсзя достаточных количеств аутснтичного бояка в прокариотичсской или эукариотичсской систсмах экспрсссии.
Прокариотичсским системам отдается предпочтение, поскольку работа с ними обходится дсшсвлс, а производительность выше. К сожалснию, нс всс микроорганизмы синтсзируют функпиональныс формы гстсрологичцых белков с одинаковой эффективностью, поэтому нсобходимо проводить сравнитсльныс количсствснныс опенки. Г!ри изучении экспрессии гена интсрлсйкииа-3 чсловска в различных клетках-хозясвах «и аилучш ни» хозяином оказалась Вас!Вил 15с)5еп5ь !оггп5х (табл. 10.4).
Хотя в одной из систсм Е со1! был достигнут несколько более высокий уровень экспрсссии, полученный бс55ок мол. массой 20 кДа прслставлял собой продукт слияния интсрлсйкина-3 с участком 1)-гялактозидазы Е. соВ, а нс зрслый аутентичный бслок мол. массой 15 кДа. Как правило, подобный химсрный балок нельзя исгюльзовать в качссгвс лскярственного срсдсз ва.
Клстки дрожжсй Тл)иугеготусез !астгу и Васс)5иготусев сегел55угае, а также клстки человека были способны гликозилировать интерлсйкин-3, однако уровень экспрсссии в них был относитсльно низок. Гликозилированис нс оказывасз зямстного влияния на активность интсрлсйкина-3, но ведет к ощутимой разницс в размерах молекулы. Стратегию конструирования новых белков путом зямсны функциональных доменов или с помощью напрявлснного мутагснсза можно использовать для усилсния или ослабления биологичсского дсйствия белка. Например, нативный гормон роста чсловска (ГРЧ) связывастся в разных типах к/!сток как с рсцспторОм гормона роста, так и с пролактиновым рсцсптором.
Чтобы избсжать нежелательных побочных эффсктов в процсссс лсчсния, нужно исключить присосдинснис ГРЧ к пролактиновому рсцсптору. Поскольку участок молекулы гормона роста, связываю5цийся с этим рсцсптором, по своей аминокислотной последовательности лишь частично совпадает с участком молекулы, который взаимодсйствуст с пролактиновым рсцсптором, удалось избирательно снизить связыванис гормона с послсдним. Для этого использовали сайт-спсцифичсский мутагснсз, в рсзультатс которого произошли опрсдслснныс измснсния в боковых группах нскоторых аминокислот (Н)з- !В, Н5а-21 и л51ц-174) — лигандов для ионов Хп, нсобходимых для !3ысокОаффинного связывания ГРЧ с пролакгиновым рсцсптором (рис.
10.2). Модифицированный гормон роста связывастся только со «своим» рсцсптором. Получснпыс рсзультаты представля!От посол!ионный интсрсс, но смогут лп модифицпрованныс ГРЧ найти применение в клинике, пока нсясно. Мов«5ф55ци ров«на«я форма ! ормоца ров!в Свят связывания с рецептором гормона роста Измененный в«я! связывании в прояякти5555выл! !я5цвитогол5 СЗГ5т вв55вл5В«55ия с Гвц«5!тором гормона роста Свят связывания с яроявктшия5ыы рецептором Нятивнвя 45орл5» гормона рост« Ряс.
! 0.2. Схсыатичссков изображснис цативной и модифицированной Форм гормона роста человска (! РЧ). С помощью олигонуклсотидцяцравясцного мутвгсцсза по55учсия Форма ГРл1, утратившая способность связываться с цролактцповым рсцсптором, по сохранившая специФичность к рецептору гормона роста. Микробнолопгчсское производство лекарственных средств 209 Тиблицгг )0.4. Уровень экспрессии гена интерлейкипв-3 в разных системах клеток-хозяев') Промггторзг Кляч кв-хозяин Уровень экспрессии, ВД Мол. масса бвзкя, кДв Метвллотионвиновы Л 20 — 40 !5 (зрелый) !5 (зрелый) 20 (химерный) 20- 100 20 — !ОО Клогкн человека Д йгьего)орви К сор К гог! 2 300 20 500 20 20 Алгилязный )осй <отх Лвктязный грякторя ко<гьюгвнгш н К. !ого« д сего»<я<не " Из рвбогы»вп Госгг ог в!., ого/гвгхно(олг9< 47 — 52, !991, с изменениями.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
