Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 54
Текст из файла (страница 54)
Серповиднаклетоиная анемия Серповидноклеточная анемия — генетическое заболевание„обусловленное заменой одного нуклеотиЛа в кодоне, который соответствует шсс- той ял~инокислоте в 1)-цепи молекулы гемоглобина. У индивидов, гомозиготных по мутантному. гену (В/.5), эритроциты имеют необычную серповидную форму; это связано с искажением конформации молекулы гемоглобина вслелствие замены в ней валина на глутаминовую кислоту. Мутантный гемоглобин не может с лостаточной эффективностью переносить кислорол, и у таких больных развивается тяжелая анемия с прогрессирующим поражением сердца, легких, мозга, суставов и других ор~анов.
У индивидов, гетерозиготных по данному гену (А/б) (»юситслей генезического заболевания), эритроциты имеют нормальную форму, и силгптомы заболевания проявлякпся лишь в экстремальных условиях (на большой высоте нал уровнем моря либо при слишком высоких или низких температурах, котла снижается снабжение организма кислородом). Если оба родителя гстсрозиготны (имеют генотип А/,5), то вероятность тог о, что их ребенок будет юмозиютным по мугантному гену (В/Б) (т. е. будет болен серповидноклеточной анемией), составляет 25%.
Ген сср1ювиш1оклеточной анемии с высокой истотой встречается среди афроамериканпев и их потомков, а также среди латиноамериканцев. В СГЦА проводят скрининг для выявления носизслсй гена ссрповндноклсточной анемии, которые могут передать этот ген своим потомкам. Рассмотрим один из используемых для этою тестов. Замена одного нуклсотида в р-глобиновом гене, приволяшая к серповидноклеточной анемии, сопровождается элиминацией сайта лля рестрицируюшей эндонуклеазы С»т1. Этот фермент узнаст последоватслыюсть ССТ)»)АСС и расщепляет молекулу ДН К межлу основаниями С и Т (Х— любой из четырех нуклеотидов). В нормальном гене эта последовательность имеет вид ССТС)АСС, а в гене серповииноклеточной анемии — ССТСТПСь Ня этом различии основывается ДНК-лиагностика данного заболевания (рис. 9.9), Используя праймеры, фланкирукчпие сайт Сгп!, амплифицируют с помощью ПЦР небольшое количество тестируемой ДНК (рис.
9.9, А). Амплифицированный фрагмент обрабатывают Сгп!, продукты рестрикции разделяют с помощью гель-электрофореза и окрашивак»т их бромистым этилием. При наличии Сгп!-сайта на электрофореграмме появляется специфический набор полос (рис. 9.9, В), отличный от такового 196 ГЛАВА 9 Участок мутант гюго г еьга Учаснгк нормаль~от гена Пр ймер Пранмер ь — 4Е!!!1Б Праймер Праймер Продукт амоанфнкацнн участка мутантного гена Снг! Снг! Размер фрагмента, но АА Генон!о А5 55' 382 Б Продукт амоггнфнкацнн участка нормального гена Снг! Сге! Стп! 2 5Гг С::::П С:::::3 С::::П 20 ! С:Ш ь.".".м 18! С::::2 ь .'3 88 с::::2 с:::::г с::::и в отсутствие Суп!-сайта.
Описанным способом можно без труда и достаточно быстро устано- вить генетический статус обследуемого, не про- водя при этом процедуру гибридизации. Метод ПЦР/ЛОЗ Нс вес гене!ические нарушения, приводящие к появлению Лефскгных генов, сопровожданугся утратой или изменением сайтов рестрикции, поэтому лдя обнаружения олнопуклеотилн ых замен применяют и другие подходы. В одном из них обьелинены ПЦР и метод, основанный па лигировании олигонуклеотилпых зондов (ЛОЗ), ПЦР/ЛОЗ.
Предположим, что в определенном сайте нормального гена (скажем, в 106-м положении) находится пара А Т, а в том же сайте мушнтного гена — С.С. Зная нуклсотилные последовательности, фланкируьощие Н)6-й нуклеотил, можно синтезировать лва коротких (20-пуклеотилных) фрагмента, прилегакнцих к данному сайту и Рис. 9.9. Вьшвление мугантного гена, ответсьвенного за развитие серцовндноклеточной анемии. А. ППР-амплнфнкания участка !)- глобиноеого гена, содержащего сайты ддя эндонукчеазьг Сгп1, один из которых отсутствует в мутантном гене. Б.
Ресгрикция полученных 1ГЦР-продуктов с помощью Сгп!. Нормальный ген содержит три Сгп)-сейте в сегмеьгш ДН К, фпанкируемом праймерами, а мутантный — лва. В. Эдектрофоретическое разделение фрагментов, подученных нрн обработке ПЦР-ампднфнцнрованной В-гдобнновой 11НК с помощью Суп!. АА — гогмозннгтность но нормальному !)-глобнновому гену, А — гетерознготность, 55'— гомознпггность по гену серновилноклеточной анемии. комплементарных противоположным цепям (рис. 9.!О).
Основная особенность этой пары олигоыуклсотилов состоит н том, что 3 -концевой пуклеотил олпого из них (зонд Х) комплементарсн основанию, находящемуся в ! 06-м положении нормальной последовательности, а 5 -ко! щевой нуклеотил второго (зонд т') комплемспларсп нуклеотнлу, примыкаьощсму к !06- му ыуклсотилу.
При отжиге этих зондов с содержащей нормальную последовательность ДНК-мишенью (амплифицированной методом ПЦР) происходит их полная гибридизация, и при добавлении в реакционную смесь ДНК-лигазы зонды Х и т' ковалснтгю ошиваются. Если жс эти зонды отжигаются с мутанпюй ДНК, в которой Произошла замена !06-го пуклеотила, то некомплементарпый ему 3 -концевой нуклсотнл зонда Х нс может образовать с ним пару.
И хотя зонд У по-прежнему гибрилизуется полностью, ДНК-лигаза не может сшить зонды Х и У. Молекулярная диагностика 197 / Зонд У Несгютветствис последовательностей Б. 1 ибрндизапия зондов с ПЦР-амплифицироввнной ДНК ~шш, '.'тш))С Мугаптная ДНК Нормальная ДНК Д Добавление лигазы Лигпрование Лигирование , б)ЛЛ;:„";ШШ) Нормальная Д1-! К Мугагп ная ДН К !: Связывание зоилов со стрептавпдином; отмывание Результаты, полученные с ьгутан гной ДНК Результатьц гюлученпыс с нормальной ДНК Лунка Д Добавлен ии' конъюгата чантитспо к дигоксигенину — одело ггия фосфатаза»; гпмывание; добавление субстрата Результап ь полученные с му1антнои ДНК Резулювтьь полученные с нормальной ДНК Рис.
9.10. Метод ПЦР/ЛОЗ. Рг — биотин; Д вЂ” дигоксиге- ннн; ЩФ вЂ” сделочная фосфа- таза; СА — стрептавидин. А. Сюпез пары олиг онуклеотидных аггее гдов Зоил Х отсутствует ЛШ',,'.ШП1 198 ГЛАВА 9 Можно синтезировать и другис олигонуклсотидныс зонды, полностьк> соотвстствующис послсдоватслыюсти с мутантным 106-м нуклсотилом. При таком наборс зондов лнгированис будет происходить в случае их отжига с муганзнои ДН К-мише|адью и нс будет в случае отжига с нормальной мишенью.
Таким образом, метод ПЦР/ЛОЗ различает две ситуации: лигированис зондов н отсутствис лигирования. Чтобы определить, произошло ли лнгированис, 5 - конец зонда Х мстят биотином, а 3'- конец зонда т' . — днгоксигснином, низкомолскулярным соединением, связываюгцимся с соответствуюшнм антнтслом. После гибридизации и лигирования проводят дспатурацию ДНК для высвобождения гибридизовавшсгося зонда и переносят смесь в небольшую пластиковую лунку, покрытую стрсптавидином. Лунку промывают, чтобы уладить весь матсриал, кроме связавн~сгося со стрсптавидином биотинилированного зонда. Затем добавляют в лунку антитела кдигоксигснину, црсдваритсльно сосдииснныс со щелочной фосфатазой.
После промывания, в ходе которого происходит удаление нссвязашюго коныогата, добавляют бесцветный хромогснпый субстрат. Окрашивянив раствора в лунке свидстсльствуст о связывании антитела к дигоксигснину с зондом, меченным дигоксигснином, т. с. о том, что этот зонд бьш лигирован с зондом, мсяс>шым биотином. Если жс окрашивання не происходит, значит лигирования нс было.
Распола~ая двумя нарами зондов, можно установить 1снстичсский статус любого человека. Напримср, ДНК гстсрозипзтных носитслсй дает положительный отвст с обеими парами зондов, ДНК лиц, обладая>щих двумя копиями нормального гсна, — только с тем набором зондов, который содсржи~ нуклсотид, комплсмснтярный нормальному сайту, и, наконец, ДНК индивидов с двумя измененными копиями гена — только с набором зондов, дстсктирующим мутантный сайт.
Чтобы минимизировать необходимое лля анализа количество исходной ДН К, псрсд гибридизацией участок ДНК-мишени, содержащий тестируемый вайт, амплифицируют с помогцьк> ПЦР. П ЦР/ЛОЗ является быстрым, !увствитсльным и высокоспсцифичпым мстодом. Все сю стадии роботизированы, что позволяет проводить до!200 тестов в день. Болсс простым, хотя и мснсс чувствительным вариантом ПЦР/ЛОЗ является метод лигаз|юй псиной реакции. Тсстирусмую ДНК смешивают с избытком двух индикаюрных зондов, описанных выше, в присугствии тсрмостабильной ДНК-лигазы.
Проводят лигированис нри б5 'С, зачем повышают тсмпсратуру до 94 С, чтобы произошла дспатуряция образовавшихся гибри- ДОВ ЗОнд — ДНК-мишень, и ВИОВь ПОБижают температуру до б5 "С лля гибридизации свободных нслигированных индикаторных ЛОЗ-зондов с ДНК-мишенью. Этот цикл повторяют 20 раз. Если индикаторные ЛОЗ-зонды полностью комплемент арны ДНК-мишани, то лнгированне будет происходить в каждом циклс, и после 20 циклов накопится достаточно продуктов лигирования («сшитых» зОндОВ Х и У) для ТОГО, чтОб!! их мОжно было обнаружить с помощью электро~)юрсза или ЕЕ(ВА.
Если комплсмснтарность неполная, то лигированис нс произойдет и никаких продуктов зарсгистрировано нс будет. Генатипирование с игпользованиел флуореецеГипно леченных Г/ЦР-праимеров Колоримстрнчсскос гснотипированис основано на применении ПЦР-праймсров, мсчснпых различными флуоресцентными краситслями. Чтобы различшгь мутантнук~ ДНК и ДНК дико1о типа, проводят ПЦР с двумя разными праймсрами. Один из них (Р1) комплсмснтарсн ДНК дикого тина и на 5 -конце помечен родамином (красный цвст), другой (Р3) комплсмснтарсн мутантной ДНК и на 5'-конце помечен флуорссцсином (зслсный ивет) (рис. 9.11).
В обоих случаях амплификацню проводят в присутствии трстьсго, нсмсчснного праймсра (Р2), комплементарного противоположной цени. Поскольку П1ЦР может идти тОлько а том случае, кОГда нраймср полностью комплсмснтарсн ДНК-мншсни, в присутствии в реакционной смеси всех трех праймеров будет амплифнцироваться либо ДНК дикого типа„либо мутацтная ДНК, либо обе они, в зависимости от ДНК-мишсни, играющей роль матрицы. Если игщивид гомозиготсн по ДНК дикого типа, то после провсдсния ПЦР и удалсния лишних п рай мс ров будет наблюдаться флуорсс~(енпия крас~ )ою цвста, если он гомозиготсн по мутантной ДНК вЂ” зслсною, а если присутствуют и мутантная ДНК, и ДН К дикого ДНК дикого типа(+) З' Му«антная ДН К( — ) Нет продукта ОЗ вЂ” с' РЗ 3' Му«ватная ДНК( — ) ПЦР (9"9 ДН К лаке го тала(«) Р2 ПЦР Нет гчх1лух«а типа (т.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
