Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 52
Текст из файла (страница 52)
В настоян!се время малярию диагностируют с помощью микроскопическогоо исследования мазков крови— эффективного, но трудоемкого и занимакяпего много времени процесса. Иммунолопьчсские методы обнаружения Р1алтог11ит, !акие как ЕЕ!ЬА, лостаточно быстрые и их легко автоматизировать, но с их помошькь нельзя отличить текущую инфскььию от прошедшей, поскольку при этом определяется только наличие антител к Р1ахтог1ьит в крови больных.
Лля избирательной ДНК-лиагностики текущей инфскььии, т. е, лля выявления ДНК возбулителн, в качестве основы используются высокоповторяющисся последовательности ДН К Р. 1гь1с1рагит. Сначала с помопьью ДНК-зонда проволится скрининь библиотеки гоночной ДНК паразита. Затем оьбираются клоны, даьощис наиболее интенсивный гибрилизапионный сигнал, поскольку именно они прелположительно содержат высокоповторяющиеся последовательности. Д)!К кажлого из отобранных клонов провернкьт на способность к гибридизаььии с ЛНК видов Р1ахтоаь1иья, не вызывающих ма,ьярию. В качестве специфического зонда выбирается последоватсльностьь ! ибридизующаяся с ДНК Р.
Ха1гьрагигьь, но нс с ДНК Р. я1тгьх, Р. супото1р'или с ДИК человека. С его помощью Молекулярная диапи1стика 189 Выявление аллелей Р-глобинового гена методом гибридизации с синтетическими олигонунлеотидами В. й Соппег, А. А. Кеуек С. Мопп, К. Иа1цна, К. 1.
Терадх, апс) )(. В. ХУа))асс Ргас 1УаИ. Лои). Уяк 12УА вел 273 — 2Х2, ! 9ЯЗ века, отличающиеся лруготлруш лишь одной парой оснований. проводя гибридизацию с протяженным (более ! ОО и. н.) зондом. В 19Х3 г. Коннер и др. синтезировали специфичные олнгонуклеотидьь способные распознавать нормальную и мутантнузо ДНК, при этом можно бьшо уста!амвгть, гомози2отен гши 1етерозиготен данный индивидуум по исследуемому гену. Для диагностики ссрповклноьлсгочной анемии они использовали лва олишнуклеотида длиной по 19 и.
нл один был комплемензарен нормальному аллелю 13-глобиноао1о гена (()~). а другой — музантному 0)а). ДНК здорового человека [(3~() ) гпбридизовалась только с Вх-зондом, ДНК больного серпо- тации. 50 тыс. жизней. Паразит широко распространен в Латинской Америке. Он переносится клопами-хнщнецами, проникает в печень, селезенку, лимфатические узлы, центральную нервную систему н, размножаясь, разрушает клетки, в которых паразитирует. Для диагностики острой формы болезни Чагаса обычно проводят микроскопическое исследование свежей пробы периферической крови. Можно использовать и другой тест, более длительный, но выявляющий паразитов с большей вероятностью. Незараженных насекомых кормят кровью пациента и через 30 — 40 сут исслелуют под микроскопом их кишечник на предмет наличия паразитов. Оба метода весьма трудоемки, дорогостояши я требуют длительного времени.
Болезнь можно диагностировать и иммунологнческими методами, однако они часто даю! ложноположительные результаты. В качестве альтернативы этим менее чем удовлетворительным процедурам было разработано несколько подходов, основанных на применении ПЦР. В насто- можно обнаруживать всею 1О пг очищенной ДНК Р. (а!с(рап7т илн 1 нг той же ДНК в крови больного. Получены н охарактеризованы более 100 различных ДНК-зондов, позволяющих обнаруживать патогенные штаммы различных бактерий.
вирусов и паразитических простейших. ! ак, имеются зонды для диагностики бактериальных инфекций человека, вызываемых (.ея!опе!!а рлеи- торЫ!а (респираторные заболевания), Яаапапе(!а )урй! (пищевыс отравления), сотру!оьасгег йуо!и)езида)!г (гастриты), а также для выявления энтеротоксичного штамма Езсйепсй!а сод (гастроэнтериты). Однако это лишь <верхушка айсбсргаа; в принципе с помо!цью гибридизации можно выявлять практически любые патогенные микроорганизмыы.
Выявление Тгурапавата его Паразитическое простейшее Тгуралгмата египет! вызывает болезнь '1агаса (южноамериканский трипаносомоз), уносящую ежегодно примерно С разработкой в начале 80-х гг. быстрых. зффектившах и нелорогих методов химического синтеза олигонуклсотилов появилась возможность использовать ралиоактивно меченные олигонуклеотплные зонды лля вьшвления различии между нуклеотидными послелошпельностями, в частности для обнаружения мужаний у человека. К тому времени было изолировано относительно небольшое число генов, главным образом а виде комплсмензарнмх ДНК (кДНК), поэтому подбор зонда, гомологичного конкретному гену, представлял собой непростую задачу.
Но да:кс если соотает— ствукицие кДНК были получены, невозможно 62яло различизь нормальный и мугантный гены чело- внлнокзеточной анемией (1)з))х)-- 1 только с 1)а-зонлохч а ДНК индивидуума, гетерозиготпого по данному гену (Вхбз), — с обоими зондами. Эта модельная система Впе))вые продемонстрировала возможность определения генотипов ! с помощью гибридизации и положила начало молекулярной диагностике мнопзх генетических заболеваний человека.
Вслед замни был разрабоган целый ряд ДНК- тестов лля вгяявления музаций, И хотя гибрпдизапионный метод сейчас уступил место более совершенным методам, таким как ПЦР и ДОЗ (лигирование олигонуклеотидпых зондов), он сыграл свою роль, проиллюстрировав возможность определения точковых му- 190 ГЛАВА 9 ящее время ПЦР-диагностика болезни Чагаса служит дополнением к традиционным, широко используемым методам. Один из ПЦР-тестов основан на выявлении фрагмента ДНК длиной 188 и. н., который присутствует во множестве копий в геноме Т.
стиг1, но отсутствует в геномной ДНК нескольких родственных паразитов. После амплификации этот фрагмент без труда обнаруживается с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Незначительно варьируя методику провеления П1(Р (например, изменяя нуклеотидную последовательность праймсров), последнюю можно использовать для обнаружения широкого спектра бактерий, вирусов и паразитов. Нерадиоактивные методы г)етекиии В большинстве лабораторий для п1бриднзации используют зонлы, меченные каким-либо радиоактивным изотопом, чаще всего з~Р.
Такие зонды обладают высокой удельной радиоактивностью и обеспечивают хорошее отноц~ение сигнал/шум. Радиоактивно меченный зонд наносят на фильтр с фиксированной на нем ДНК- мишенью, проводят гибридизацикц отмывакп несвязавшуюсв ДНК-зонд и детектируют метку с помощью радиоавтографии. Однако з~!' является короткоживущим изотопом, испускающим высокоэнергетическое излучение; при работе с ним необходимо использовать специальное оборудование и обеспечивать безопасную утилизацию отходов. Чтобы обойти этн трудности, были созданы нерадиоактивные системы детекцин.
Для усиления гнбридизацнонного сигнала в этом случае используется ферментативное превращение хромогенного нли хемилюминссцентного субстрата: первый из них пол действием фермента изменяет окраску, а второй испускает свет. В большинстве подобных систем применяются ДНК-зонды, содержащие биотинилированные нуклеотиды. Гибридизация н детекция сигнала проводятся более или менее стандартным образом. 1. Зонд, меченный биотином, гибридизуют с ДНК-мишеньк> (рис. 9.4, А). 2. Промывают фильтр для удаления избытка несвязавшегося зонда.
3. Добавляют авндин (белок куриного яйца) или стрептавидин (бактериальный аналог авидина) (рис. 9.4, Б). 4. Добавляют биотинилированный фермент— щелочную фосфатазу или пероксидазу хрена (рнс. 9.4, )1). 5. В зависимости от используемого фермента добавляют хромогенный или хемилюминесцентный субстрат и регистрируют изменсние окраски либо люминесценцию, сопровождающую превращение субстрата в продукт (рис. 9,4, Г). В качестве альтернативы после гибридизации ДНК с биотиннлированным зондом можно добавлять уже готовый комплекс стрептавидин — фермент, имеющий сайт связывания с би отин ом.
Как авидин, так и стрептавидин связываются с биотином очень прочно (константа диссоциапии (К = 10 и); кроме того, каждый из белков имеет четыре независимых биотинсвязывающих сайта, благодаря чему одна молекула авидина или стрептавидина может одновременно присоединять фермснт и зонд, меченные биотином. Биотинилирование н связывание со стрептавидином не приводят к снижению ферментативной активности.
В хромогенных системах детекции в том месте, где находится гибридная ДН К, под действием фермента образуется нерастворимый краситель, а в хемнлюминесцентных системах — продукт, который испускает свет. Нерадиоактивные системы детекции обладают и друпзми преимуществами: биотянилированная ДНК остается стабильной при комнатной температуре как минимум год; методы регистрации хемилюминесценции обладают такой же чувствительностью, как и методы регистрации рьшиоактивного сигнала; детекция испускаемого света при помощи рентгеновской пленки или люминометра, как и регистрация изменения цвета, занимают несколько часов. По-видимому, хемнлюминесцентные системы регистрации сигнала, все же более чувствительные, чем хромогенные, вскоре вытеснят все остальные, использующиеся при ДН К-диагностике.
Если при этом применяется ПЦР, то амплифицируемый продукт можно пометить флуоресцентным красителем, присоединяя его ® — Ьяотян дик-мишень Стрелтавидия ,ф ШФ !ч Я-4©Ф )~~~и«!Фу — «91!) . !с * «(цФ>( ~( ~1~Ф» — ~'!)) Я вЂ” е!!!ФЯ О: Г!-,) ОО .К) О сцируюший ролую. к 5 -концу каждого праймера. В качестве красителей часто используют флуоресцеин и родамин, которые испускают зеленый и красный свет соответственно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
