Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 47
Текст из файла (страница 47)
Триозофосфатизомераза состоит из двух идентичных субьединиц; каждая из них содержит два остатка аспарагина, замена которых может приводить к изменению термочувствительности белка, поскольку они расположены в месте соприкосновения субъединип. При полюши олигонуклеотид-направлешюго мутагенеза были заменены остатки аспарагина в положспиях 14 и 78 (табл. 8.3).
Замена одного из них на остаток треонипа или изолейцина приводила к повышению термостабильности фермента, на аспарагиновую кислоту — к понижению. Фермент, полугающнйся при замене обоих ост пков аспарагина на остатки аспарагиновой кислоты, оказался нестабильным даже при нормальной температуре и обладал низкой фермен ппивной активностью (в табл. 8.3 не представлен). Оценка чувствительности рекомбинаптпых белков к протеолитическому расщеплению показала, что существует положительная корреляция между термостабильносгью белка и его устойчивостью к прспеолитическому расщеспекнпо. Полученные данные говорят о возможности создания термостабнльных форм других ферментов путем замены несущественных остатков аспарагина.
Уменьшение числа свободных сул747гидрил ьных групп Чужеродный белок, синтезирусмый' в организме-хозяине„иногда оказывается менее активным, чем ожидалосун и чтобы повысить его активность, можно использовать методы генной инженерии. Например, при экспрессии в Е. еос! клопировашюй комплементарной ДНК (кДНК) ~3-интерсйерона человека (ИФ1)) белковый продукт обладал в ! 0 раз меньшей противовирусной активностью, чем нативная гликозилированная форма. При этом ИФР синтезировался вдоволь- но большом количестве„однако почти все еп7 молекулы образовывали димеры и более высокомолекулярные неактивные комплексы. Как показал анализ нуклсотидной последовательности гена ИФ!), в нем присутствук5т три остатка цистеина, и один из них или несколько, возможно, участвуют в образовании дисульфидных связей, приводящих к образованию димеров и олигомеров в клетках Е.
сог!) но не в клетках человека. Было высказано предположение, что замена одного или нескольких цистеиновых колонов на сернновые приведет к синтезу интерферона, пе образующего олигомеров. Серии был выбран потому, по его структура сходна со структурой цистенна за исключением того„что вместо серы он содержит кислород и поэтому не может образовывать дисульфидные связи. Приступая к эгнм экспериментам, исследователи не располагали детальной информацией апюсительно молекулярной структуры ))-интерферона и были вынуждены опираться на соответствующие Направленный му(агенез и (синая инженерия белков !7! 1л(нные для родственных белков.
Иными словами, опи нс знали, какой из трех остатков пистеина бьщ Оп(етствен за формирование межмолскулярных дисульфидных связей. К счастью, локализация остап ков ццстеиня, участвующих в образовании внутримолскулярных дисульфидных связей в молекуле И Фа с аналогичной структурой, была известна, что делало возможным сравнение амипокислотных последовательностей этих двух молекул (рис. 8.8). Как показали результаты анализа, остатки Суз-31 и Сух-!41 в ИФ(3 нахолятся в тех же позицььях, что и остатки Суз-29 и Суз-138 в ИФОС Поскольку последние участвук3т в Образовании в ИФа внугримолекулярных дисульфидных связей, было разумно предположить, что Суз-17 в ИФ!) не вовлечен в формирование таких связей н его можно заменить. Это пред(юложение оказалось правильным: при синтезе в клетках Е.
Сой Бег-17-ИФ() мультимерные комплексы не образовывались. Кроме того, этот интерферон обладал такой же удельной активностью, как и аугентичнь(й нативный ИФ!), и был более стабилен при длительном храпении, чел( нятивная форма. Ряс. 8.8. Локюп(запия останков пистеиня в молекулах ИФа и ИФ!1, между которыми образуются дисульфидные связи. Выявленные впутримолекулярные дисульфвлные связи в ИФа обозначены нггриховыми линиями, а предполагаемая связь в ИФ(! — пунктирной. Повы(иенце ферментативнои ик(ливности С помощью направленного мугагенеза можно не тОлькО повыш(1ть стабиь!ы!Ость (рермснто13, по и изменять их катялитичсскую активность. В настоящее время для существенного изменения (рерментати13но!й актщ3НОсти л(ОбОГО ЛОстято'гь!О хорошо охарактеризовашюго фермента необходимо располагать летальной информяписй о геометрии его активного центра.
В этом случае можно предсказать, какие замены необходимо произвести для изменения специфичности фермента к данному субстрату. Возможности данного подхода иллюстриру(от результаты эксперимента по изменению спепифичности связывания субстрата тирозил-тРНК вЂ” синтетазой из В.
з!саго(!(егтор7нуи». Этот фермент катализирует аминоацилнровапие тРНК, которая специфически связывас( тирозин (тРН Кть'), в ходе лвухступепчятой реакции: (1) Туг + АТР— 3 Туг-А + РР,. (2) Туг-А + тРНК 1 1' — 3 Туг-тРНКТ3' +АМ Р 1 г 172 12!АВА 8 Таблица Д4. Эффсктннносп нминога1ини!юннним, осуагесты1яемоготгативной (Тйг-51) и модифицированной (А!8-5! и Рпт-51) тирозил-7РНК вЂ” ситггетазами" йеы. с ' Фермент , мги 2,5 1,2 0,0!9 Твг-51 Л!8-5 ! Ргр-5! !860 3200 95 800 4,7 4,0 1,8 '1 па ем ит теле рабаты ь имааоа е1 а1, мам е 887 е 187- 188, ! 984 На стадии 1 ЛТР активирует тирозин (Туг), в результате чего образуется связанный с ферментом тирозиладенилат (Туг-Л) и пирофосфат (РР,).
На стадии 2 тирозиладенилат гидролизуется при участии свободной 3'-ги7!роксильной !руины молекулы тРНК, так что тирозин присоединяется к тРНК с высвобождением ЛМР. В ходе обеих реакций субстраты оста!отея связанными с тирозил-тРНК вЂ” синтетазой. Ко времени постановки эксперимента была определена пространственная структура тирозил-1Р11К вЂ” синтетазы В, 87еогогйегтор1711из и локализован се акт,ивный центр, так что при помощи компьюте!7нгтго модели17ования можтю было предсказать влияние зал!сны в нем одного или нескольких аминокислотных остатков на взаимодействие ферме!па с субстратами.
Чтобы проверить правилыюсть прогнозов, с помощью олигонуклеотид-направленного мута1енеза в ген тирозил-тРНК вЂ” синтстазы были внесены специфические мутации. Остаток трсонина в положении 51 (Тйг-51) был заменен на остаток аланина или пролина. В нативном ферменте гидроксильпая 1руппа Тйг-51 образует водоролную связь с атолюм кислорода рибозного кольца тирозиладенилата.
и предполагалось, что разрыв этой слабой связи увеличит сродство фермента к ЛТР. Чтобы охарактеризовать получившиеся ферменты, определили их кинетические константы. В некоторых случаях изменения оказались более существенными, чем ожидалось (табл. 8.4). Так, если для Л)а-51-фермента консганта связывания (Км) с АТР уменьшилась примерно в два раза без значительного изменения качалитичсской константы (А;м), то для Рго-51-фермента — более чем в 100 раз. При этом каталити- ческая эффективность (к,м/К81) реакции аминоацилирования увеличилась в обоих случаях. Результат, полученный для Рго-5!-фермента. был неожиданным, поскольку замена треонина на пролин должна была привести к нарушению (по крайней морс локальному) сгруктуры гл-спирали в этой области, что предположительно должно отрицательно сказаться па связьвании субстрата. Эти двинь!с показывают, что несмотря на всю сложность и ро1.позирования результата специфических аминокислотных замен, с помощью описан ного 1юдхода все же можно идентифицировать боковыс группы, замена которых приведет к улучшению кинетических свойств фермента.
Кроме того, стало очевидно, что сродство данного фермента к субстрату, а также каталитическую эффективность реакции можно повысыть !п 91!го. внося сгютвстствуюшие изменения в клонированный ген. Изме71е71ие «отребности трерме7гтов в металлических кофокторох Субтилизинь1 — ссрииовыс протеиназь1, секрс- тИРУЕМЬ1С В кУЛЬтУРаЛЬНУЮ СРЕДУ ГРаМПОЛОжнтсльпыми бактериями, — широко используются в качестве биолеградируемых детергентов. Все они прочно связывают один или несколько атомов кальция, повышающих их стабильность. К сожалению, субтилизины используются в таких промышленных процессах, где участвуют в болыпих количествах соединения, хслатируюшие металлы, в том числе кальций, и в таких условиях субтилизины быстро теряют свою активность.
Чтобы решить эту проблему, попытались сначала лрпнгггь субтилизин способности связывать кальций, а !атем увеличить стабильность модифицированного фермента. Получение модифицированного субтилизина было начато с идентификации 1ена ВР18' Вос(11их ату101цие1осгеоб. Прежде всего с попомшью рентгеноструктурного анализа высокого разрешения была определена структура белка, а затем с использованием олигонуклеотид-направленного мутагенеза создан мутантный ген с делегированными нуклеотидами, кодируюшими участок белковой молекулы от 75 Наш|бетонный му |а| снст н Гснндт| ннжьнсрин белков 173 ло 83 алшнокисло|но|о остатка, который отвечал за связывание кальция. белок с лслсцисй нс связывал кальций и, что удивительно, сохранял конформациют схолцую с заковой псхопного белка.
Далее лля повышения стабильности субтилизина без кальциисвязываюшего ломспа илентифицировюш сайты, которые необходимо изменить, и аминокислотныс остатки, которые нужно ввести в эти сайты. Бь||цз высказано предположение, что вес аминокислоты, взаимодействующие с кальцийсвязывающнм доменом в исходном ферменте, нс являклся оптимальными в новых условиях. В качестве кандилатов были выбраны (О аминокислот, а |юскольку заранее не было известно, включение какого именно аминокислотного остатка приведет к наибольшей стабилизации фермента, лля внесения изменений в каждый из 10 сайгон использовали случайный мутагенез. Выбршп|ые аминокислоты были локализованы в четырех разных областях белковой молекулы: 7ь'-концсвол! участке (остатки со 2 по 5), в ол|сга-петле (остатки с 36 по 44), в сл-спиральной области (остатки с 63 по 85) и в олпом из 13- слоев (остатки с 202 по 220).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
