Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 50
Текст из файла (страница 50)
Лг .8: ! !3 ЫО, !99К необходимо сначала вырастить культуру потенциально патогенного микроорганизма и лишь затем проанализировать спектр его физиологических свойств. Хотя подобные тесты весьма эффектинны и обладают достаточно высокой специфичностью, они часто занимают много времени и являются дорогостоящими. Это относится к идентификации и бактерий, и паразитических микроорганизмов !табл. 9.! ). Кроме того, весьма ограничена возможность выявления тех патогенных микроорганизмов, которые пло- 182 ГЛАВА 9 хо растут в культуре либо вообще не поддаются культивированию.
В качестве примера можно привести облигатных внутриклеточных паразитов Сгг(аглуИ!а ггас)ггглгаггз, которые вызывают хламилиоз, болезнь, передающуюся гголовылг путем и распространенную в Северной Америке н Европе. Хламггдноз трудно диагностировать, поскольку для этого необхолима перевиваемая культура клеток. При этом часто получают ложноотрицательные результаты (т. е. ошибочно Лиагностирукл. отсутствие микроорганизма), в резулщате чего не проводится адекватное лечение. Ьезусловно, если для выявления микрооргаггглзма необходимо выращивать его в культуре, то рутинной может стать идентификация лишь нескольких из всех известных патогенных микроорганизмов. Чтобы устранить это принципиальное ограничение, были разработаны методы молекулярной лиагностики, в основе которых лежат иммунологнческие пояходы или метолы обнаружения специфической ДН К.
Любой метол выявления патогенных микроорганизмов лолжен быть ггостаточгго простым и облалать высокой специфичностью и чувствительностью. Специфичный диагностический тест гюлжен лавать положительный ответ только на микроорганизм- или молекулу-мишень, чувствительный — обнаруживать очень малые количества такой мишени лаже на г)юне других микроорганизмов или молекул, загрязняющих образец. Простота метола полразумевает, что он является достаточно пролуктивным, эффективным и недорогим лля рутинного применения. По оценкам спепиалистов„объем мирового рынка иммунолиагностических тестов в 1993 г.
составил 3,4 млрл. долл. США и в ближайшие 1Π— 15 лет будет возрастать на 5 — 10% ежеголно. В ! 994 г. объем мирового рынка ДНК-диагностических тестов бьгл равен примерно 80 млн. долл., к 2000 г. он, по-виднмому, составит 600 млн. долл., а к 2004 г. -- 2 млрл. долл. В этой главе мы обсулим принципы некоторых метолов молекулярной лиагносгнки и сферу нх применения. Методы игимуиодиагностиии Многие иммунологические системы детекции обладают высокой чувствительностью и специфичностью, являясь в то же время лостаточно простыми. Они широко используются для тестирования лекарственных препаратов, оценки и мониторинга различных онкологических заболеваний, определения специфических метабояитов, идентификации и контроля патогенных микроорганизмов, но имеют и свои ограничения.
Если молекулой-мишенью является белок, то необходимо обеспечить экспрессию летерминируюнгих его генов и создать условия, в которых не происхолит маскирование нли блокирование сайта связывания с антителом. граяиггионные процепуры Ггиагггосгики возбулителей инфекции опираются либо на набор характеристик патогенного микроорганизма, либо, что предпочтительнее, на одну уникальную, легко различимую его особенность. Клинические микробиологи пытаются найти тот минимальный набор биологических характеристик, при помощи которого можно булет гарантированно обнаруживать и илентифицировать патогенные микроорганизмы.
Например, некоторые возбудители вырабатывают специфические биохимические соединения, которые и необхолимо обнаружить в биологическом образце. Часто полобную маркерную молекулу можно выявить непосредственно, проведя высокоспецифичный биохимический анализ. Но такой подход неизбежно приведет к увеличению числа индивидуализированных систем Легекции патогенных микроорганизмов. Более предпочтительным был бы универсальный метоЛ, позволяющий выявлять любую маркерную молекулу независимо от ее химической природы. Именно таким является метол, основанный на илентификации комплексов антиген-антитело. Фе)ггиенгяный иммуносорбеннгный анализ Существует целый ряд полхолов, позволяющих определить, произошло ли связывние агпитела с агпигеном-мишенью.
Олин из них — это ферментный нммуносорбензный анализ (ЕДВА), который часто используют для диагностики. Процедура включает следующие этапы (рис. 9.1). !. Образец, в котором хотят обнаружить специфическую молекулу или микроорганизм, фиксируют на твердой подложке, например на пластиковой микротитровальной плашке, обычно имеющей 96 лунок (рис. 9.1, А). 2. К фиксированному образцу добавляют анти- тело, специфичное к маркерной молекуле (первое антитело), затем промывают лунку, чтобы удалить несвязавщиеся молекулы первого антитела (рис. 9.1, Б). 3. Добавлягот второе антитело, которое специфически связывается с первым антителом и не взаимодействует с маркерной молекулой (рис. 9.1, В).
К атому антителу присоединен фермент (например, щелочная фосфатаза, пероксидаза или уреаза), катализирующий превращение неокрашенного субстрата в ок- л Фиксвпнв обратпа на твердой полло;кке Антнгенный саят Мсшекула-мишень Д Добавление первого антитела; промывание лунки а Добавление конъюпша второе ангнтъшо-фермент: промынание лунки Фермент, Второе а~~тигеле присоединенный ж л' ко второму К Добавление субстрата краше1 шы Рис.
9.1. Обнаруженггс а|пигена-мишени с помощью Е(.ЮА. Е--фермент, присоелнпен- ный ко второму антителу. Молекулярная диагностика 183 ращенный продукт. Промывают лунку, чтобы удалит'ь несвязанщиеся молекулы конъюгата второе антитело-фермент. 4. Добавляют неокрщленный субстрат(рис. 9.1, у). 5. Проводят качественное или количественное определение окрашенного продукта. Если первое антитело не связывается с мишенью образца, то оно удаляется прн первом промывании. Поскольку при этом конъюгату второе антитело — фермент не с чем связываться, он удаляется нри втором промывании, и образец О Ф (') — Неокрашенный б а 1Х4 ГЛАВА Ч остается неокрашенным.
Если связывание с мишенью происходит, то второе антитело присоединяется к первому, и коньюгированный фермент катализнрует образование легко регистрируемого окрашенного продукта. Основной принцип ЕЕ)ЯА — специфическое связывание первого антитела с мишенью. Если молекула-мишень прелставляет собой белок, то его очищенный препарат обычно используют для получения антител, при помощи которых затем и выявляют данную мишень. Антитела, которые образуются в сыворотке (антисыворотке) крови иммунизированного животного (обычно кролика), связываются с разными антнгенными детерминантами (эпизопами) молекулы-мишени. Такую смесь антител называют полнклональным препаратом.
Использование поликлональных антител имеет два недостатка, существенных для некоторых методов диагностики:!) содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от одной партии к другой; 2) поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различить лве сходные мишени, т. е. когла патогенная (мишень) и непатогенная (не-мишень) формы различаются единственной детерминантой. Однако эти проблемы вполне разрешимы, поскольку сейчас научились получать препараты антител, выработанных к одной антигенной детерминанте, т.
е. препараты моноклональных антител. Моноклональные антигнела У млекопитающих в ходе эволюции выработался сложный набор клеточных систем, защищающих организм от токсичных вещес|в и инфекционных агентов. Составной частью запгитной реаизии является индуцированная выработка клетками лимфатической системы специфических белков (антител), которые соединяются с чужеролными ве1цествами (антигенами) и при помощи других белков иммунной системы, включая системы комплемента, нейтрализуют их эффект.
В ответ на иммунологический спь мул каждая антителопродуцирующая клетка синтезирует и выделяет единственный вид антител, которые с высоким сродством распознают отдельный участок (эпигон, антигенную детерминанзу) молекулы антигена. Поскольку в мо- лекуле антигена обычно присутствует несколько разных эпитопов, антитела против каждого из них вгярабатываются отдельными клетками иммунной системы. Такие антитела, каждое из которых взаимодействует с данным антигеном, называют поликлональными.
Уже в начале нынешнею века, котла о поликлональности антител ничего не знали, было ясно, что их специфичность можно использовать для подавления инфекций. Позже антитела стали применять в качестве диагностического инструмента для выявления токсичных соединений в клинических образцах. К сожалению, эффективность пре~ ~аратов поликзональных антител варьирует от одной партии к другой, поскольку в олних случаях при провелении иммунизации антителопролуцнрующне клетки сильнее стимулируются одними детерминантами данного антигена, а в других иммунная система активнее отвечает на другие эпигоны того же антигена.
Это может влиять на способность разных препаратов нейгрализовать антигены, поскольку отдельные эпигоны обладакп разной эффективностью (стимулирующей способностью). Следовательно, в данной партии поликюнальных антител может соЛержаться мало молекул, направленных против основною эпитопа, н в результате она будет менее эффективной, чем предычущая. Следовательно, для практического применения антител в качестве диапюстического инструмента или компонентов терапевтических средств необходимо было создать такую линию клеток, которая росла бы в кулшуре и продуцировала антитела одного типа, обладающие высоким сродством к специфическому антигону-мишени, — моноклоналы~ые антитела. Подобная клеточная линия могла бы стать неиссякающим источником илентичных молекул антз1тел.
К сожалению, В-лимфоциты (В-клетки), синтезирующие антитела, не могут воспроизводиться в культуре. Решение данной проблемы вплелось в создании гибридной клетки. Получив генетическую составляюп1ую от В-клетки, она могла бы вырабатывать антитела, а приобретя способность к делению от клетки совместимою типа— расти в культуре. Было известно, что В-лимфоциты иногда перерождаются и становятся раковыми (миеломными) клетками, приобретая спо- Молек>парная аиьз ностика )85 собносгь к росту в культуре и сохраняя в то же время многие свойства В-клеток.
Так клетки миеломы, в первую очередь те, которые не вырабатывакп. антител, стали кандидатамн на слияние с антителопродуцирукпцими В-клетками. В серелнне 70-х гг, эти идеи стали реальностью. Образование и отбор гибридна>х клеток Первый шаг в процессе получения гибридной клеточной линии, пролуцирующсй антитела одного типа, состоит во введении мьпцам антигена. После ряда иммунизаций, проведенных в течение нескольких неяель, проверяют. произошло ли развитие у животных иммунного ответа. Если ответ развился, то животных умерщвляют, извлека>от селезенку, промывают ее, измельчают и нес>ильно встряхивают для высвобожаения елиничных клеток, среди которых находятся и антителопролуцирующие В-клетки.
Взвесь клеток селезенки смешивают со взвесью миеломных клеток, дефектных по гнпоксантин-гуанин-- фосфорибозилтрансферазе (НОРКТ ). Комбинированную взвесь в ~ечение нескольких мину> инкубируют в 35%-ном полиэтнленгликоле, а затем переносят в среяу, солержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (срела ГАТ). Обработка полнэтиленгликолсм облегчает слияние клеток, тем не менее слияние происходит редко и является в достаточной степени случайным собьпием. В смеси присутствуют клетки мнеломы, селезенки, а также слившиеся клетки миеломы — селезенки, миеломы — миеломы, селезенки — селезенки. Однако в срелс ГАТ растут только гибридные клетки миеломы — селезенки, все остальные типы кле>ок не могут в ней пролиферировать.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
