Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 46
Текст из файла (страница 46)
Коне шо, Таблица Я. Л Некоторые ферменть! и области их и!зимепспий Фврмвит и римвивиие и-Амиаазв Пизювзреиис, производство соиртв Поиучшзив 1:вмипокислоз Рвзлип чеиив мяса, осветление соков Амиповпилвзв бгюмвлвип Квтазвзв Аитиоксилвит в ~ отовыл к упогрвбвсиию пишевых оролукзвх ! 5олучвиие спирта и гл5окозы Рвзмясчеиив мяса, осввтлеиис соков 1!вал юлвзз Фипии !'люковмиллзв Глюкозоизомервзв Пивовврсиие, произволсгво спирта Произволство сиропов с высоким солвржзи 1юм фруктозы Аитиоксиллит в готовых к употрвблв1 ~ию пишввых пРодуктах Инверсия свхврозы Утюшзлпил сыворотки, гилролиз лвктозы Глюкозооксилвзв Ииввртвта Лактазв Липвзв Сыровврвн ив, зкшучвние вромшизвторов Рвзмвоюнгю мвсв, осввзлсиив соков Пвплии Пвктипазв Осввзлвпив соков, произвопсгво спирзв Лсгвргвит, произволсзво спир'зв Сыровареиие Протевзз Реиисг задача, но зачастую только так можно выявить белки, обладающие новыми свойствами.
Как только эта задача решена, определякж нуклеотидную последовательность соответствующего клонированного гспа и ияентифипируют измененный сайт(сайты). термостабильные ферменты можно вылелить из термофильпых микроорганизмов, олнако эти организмы не всегда синтезируют именно тс специфические ферменты, которые нужны. Впрочем, эти трудности можно преодолеть при помощи направленного мутагенеза и клонирования генов-мишеней. Образование донолнинзельньгх дисульфидных связей Термостабильность белковых молекул можно повысить, внеся вних изменения, благодаря которым они польше не разворачиваются при повышении температуры. Кроме того, такие термостабильные белки часто не разрушаются в органических растворителях и при нсфизиологических условиях (например, при экстремальных рН).
К значительнол5у повышению стабильности белковой молекулы может привести образование в ней дополнительных дисульфилных связей. Основная 55роблелга здесь заклкзчается 53 тОм, чтОбы эти связи не мешали нОрмальному функционированию белка. В одном из экспериментов при помозци олигонуклеотиднаправлешюго мутагснеза были созланы шесть вариантов лизоцима фага Т4 с новыми внутрипепочечпыми Лисульфидными связями.
Для экого два, четыре или шесть специфических аминокислотных остатков в полинуклсотидпой цепи были заменены на остатки цистеипа, в результате чезо образовалась одна, лве и три дисульфиа55ых связи соответствегню (табл. 8.2). Аминокислотныс оста ! ки, замененпыс на остатки цистеица, располапц!ись в акгивном ферменте близко друг к другу, так что при образовании новых лисульфидных связей общая конформация молекулы существенно не изме! !алась. Кроме того, опи пахолились пне активного центра фермента — области, наиболсс чувствительной к малейшим изменениям конформации.
Связи образовывались мсжлу остатками 3 и 97, 9 и 164, 21 и 142 (начало нумерации с !ч)-конца). После му-гагснеза мутантные гены идентифицировали и экспрессировали в Е. со)1, рекомбинантные белки очищали и определяли их фсрментатнвную активность и термостабильность (табл. 8.2). Последняя обычно характеризуется температурой, при которой молекула дснатурирует на 509а, степень денатурации определяется 11нпрапленпый мутагенез и генная инженерия белков 169 Таблица с(2 Свойства лнзопимн 1 4 и щсс> и его вариантов, > я>лу >епных с помощью >симой япжспсрпи > «! недо связей 164 и — Э Л, тме 'С «ж Положения вмннокнс.зотных остатков Фермент 54 97 142 Суз Су5 П>г Л1в Т!>г Су5 1 Ь' Л>д т1>г Л>я ТМ Су« 'Пп А1е Т1>т Суз Двляй«НП Псевдоянкнн тип Л в С 13 Е р Пе Пе Пн' Пс Пе т1>т Су« Пе 1 Ьт Пе Суз Тлт Пс Пс Суз Суз Суз Тьт Пе Су> Суз Суз Суз Гу« 1.ео !ен 1.«о Су« !ен Суз Су« Суз 100 100 9Ь 106 0 95 0 0 тьг Т>н ТЬ« ТЬ Суз ты Суд С>ъ 41,9 41,9 46.
7 4а,з 52,9 57,6 58.9 65,5 П Под«нным работы М»н«нже«е« «>., Л«>ые 342?9> 293, !989 >ю изменению кругового дихроизма раствора белка. Исходная (нативная) форлса лизоцима Т4 содержит два своболных остатка цистеина, нс участвующих в образовании дисульфидных связей. У фермента так называемого «псевдсщикого типа» они заменены на остатки Т)н и А1а, при этом активность и термостабильность с!>ермонта остались прежними. Последовательность «пссвлодикого ти! >а» служила стандартом при сравнении вариантов с потенциально тсрмостабилизируюсцими дисульфидными связями и также предотвращала образование случайных дисульфидных связей между вновь внсденными остатками цистеина и остатками, присутствующими в нативном белке. Результаты этого эксперимента показали, что тсрмостабильность фермента повьппается при образовании новых дисульфидных связей, при этом наиболее термостабильным является белок с максимальным числолс таких связей.
Однако некоторые варианты (С, Е и Г), будучи более термостабильными, чем нативный фермент или фермент «пссндоликого типа», не обладают ферментативной активностью. Возможно, это обусловливается искажением конформации белковой молекулы при образовании дисульфидной связи между остатками 21 и 142. Хотя создание новых белков с помо!цып методов генной инженерии часто представляет собой эмпирический процесс (т. е.
далеко нс все>да бывает ясно, замени каких именно аминокислот позволяют получить «наилучший» вариант),описанный эксперимент показывает, что получение термостабильных белков с дополнительными дисульфидпыми связями вполне реально. Была пред>!рината также попытка получения термостабильной мутантной ксгщаназы 6ас!!!яз с!гсс>!апз — фермента, который можно использовать при производстве бумаги. Одним из эталон этого процесса является удаление гсмицсллюлозы из пульпы с целью ес отбслинания, при этом образук>тся болыпие количества токсичных отходов.
Обработка древесной лсассы ксилапазой позволяет использовать меныпс отбсливающих химикатов. К сожалению, перед добавлением фермента пульпу обрабатывают горя юй щелочью, а поскольку соврсмепныс технологии инск>т тенденцию к уменьшению количества воды, расходуемой на охлаждение пульпы, ксиланаза должна оставаться активной при относительно высоких температурах. Чтобы опрелслить, в какие участки полипептидной цепи могут быть введены одна, две илп три дисульфидных связи для стабилизации ферме! >та без нарушения его каталитичсской активности, использовали компьютерное моделирование пространственной структуры ксиланазы.
Были получены восемь производных ксиланазы 2). с!ген>аз>3. Все опи обладали более высокой термостабильностью, чел! нативпый фермент, и при этом три были столь же активны при 60 "С, как и нятивный белок, а один, содержащий дисульфидную связь между )Ч- и С-концами, был даже в два раза более актинным н сохранял свыше 85% своей активности после 2-часовой ипкубации нри 60 С, в то время как на>ивный ферме>п полностью утрачивал активность в этих условиях уже через 30 мин.
Успех этих экспериментов показывает, что данную стратегию можно использовать для повышения термостабиль- 170 ГЛАВА 8 ности различных ферментов, если только для них имеются достаточно полные рентгсноструктурные данные. И тем нс менее гюка нельзя быть уверенным, что термостабильная ксиланаза будет широко использоваться при производстве бумаги.
Таблица 8.3. Стабильность при 100 С триозог)юсфат- изомервты дрожжей н ее генноннженерных варны !тов" !Вора!опт Наложения аминокнелопгык Время полужпапи, оеппков мип 12 17 1б 25 !! Аьп Дикий тип А В Атп тсе пе пг Аап Аап 'пгг Аьр " Па!!вннглм раГюгм Авьгл а! а!., ргаг. Агав Лгаа бтч и5! Вд: б75-б79, 5987.
тгрмаатабнлмюап фгрманга апгнинакв как время ггатевггггггн !скорость инактнвапнн фермвюа) прн !ОО 'с. чам ано бальюа. там балла стабилен фгрман г Замена асгсарагипа на другие аминокислогпы При высоких температурах остатки аспарагина и глутамина могут дезамиднроваться с образованием аммиака. Теряя амилну5о группу, они превращаются в аспарасиновую и глутаминовую кислоты соответственно, что приводит к локальным изменениям конформации полипсптидной цепи и как следствие — к утрате активности белков, в которые они входят. Чтобы установить, какое влияние оказывает замена некоторых остатков аспарагина в молекуле триозофосфат-нзомеразы ЯассЬагогпусеу сегерсйгае на свойства фермента, были поставлены специальные эксперименты.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
