Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 55
Текст из файла (страница 55)
е. индивид гетерозиготен) — желтого. Этот метод можно автоматизировать и адаптировать для любого однонуклсотианого сайта-м ишепи в любом гене с известной нуклеотидной последовательностью. Ряс. 9.Н. Обнаружение точковой му«анни с помощью флуоресцентно меченных ПЦР- нраймеров.
А. Используя п(таймеры Р) и Р2, ампл»~фицируют ДНК дикого типа. Мутантная ДНК при помощи данных праймеров не амплифицируется из-за несоответствия ей праймера Р1. 5 -конец нраймера Р! помечен роламином, праймер Р2 немоченый. Б. Используя праймеры РЗ и Р2, ам~иифицируют мутантнук> ДНК; ДН К дикого типа в этом случае не амплифицируется. 5'- конец праймера РЗ помечен флуоресцеином, праймер Р2 немеченый. Знаки «+» н « †» соответствуют сайту дикого тина и мутангному сайгу. В случае генотипов . +/+», «+/ †» н « †/ †» образуются ПЦР-продукты, содержащие только родамин, смесь рода- мина н флуоресцсина и только флуоресцеин, и соответственно наблюдается красная, желтая н зеленая флуоресценция.
Молекулярная диагностика 199 Мутации в разных сайтах одного гена Далеко не все генетические заболевания обусловливаются одним специфическим изменением в гене. В большинстве случаев мутации происхо- 200 ГЛАВА 9 лить к р-талассемии, необходимо провести по крайней мере восемь разных тестов. Такая диагностика возможна, хотя и несыта дорогостояща. Поэтому для скринннга мутаций, возникакы щих в разных сайтах одного гена, была разработана стратегия ПЦР/гибридизация, основанная на проведении одной реакции. Для этого синтезируют набор специфических 20-нуклеотидных зондов, каждый из которых полностью комплементарен фрагменту гена-мишени, несущему известную мутациго.
К 3 -концу каждого зонда присоединен гомополимер ро!у(г)Т) длизюй Мембрана Б. Гибридизация с ПЦР-амид!н)зицнрованиыми биотинняированными Фрагме~пами гена-мишени ٠— Биотнг! ДНК-ми~леиь- ТТТТТ ТТТТТ ТТТТТ вЂ” Конъюгат стреитавидии — взяло шая ФосФатаза еще-СстТ~,у ТТТТТ ТТТТТ ТТТТТ Л Добавление субстрата дят в разных сайтах в пределах одного гена, но приводят к одному генетическому заболеванию. В качестве прилзсра можно привести !3-талассемию— наследственное заболевание„связанное с утратой активности !3-глобина. У гетерозиготных носителей при этом обычно наблюдается небольшая анемия.
Индивиды же, гомозиготные по одному из как минимум восьми возможных мутантных сайгон, для поддержания жизни нуждаются в регулярном переливании крови и друпум лечении. Поскольку мутация в любом из восьми специфических сайтов !3-глобинового гена может приво- ж Связывание специфических зандоа с мембраной Зоил! Зонд 2 Зонд 3 тттттГ тт!тт ттттт~ Д Добавление конъюгата стреитааидпи — шелочная ФосФатаза Нсокрашенцый субстрат Нерастворимый О! окраи!синий нролукт й' 3ДФ Сй:.Д чван ТТТТТ ТТТТТ ТТТТТ Рне. 9Д2.
Выявление мутаций в разных сайтах одного гена. Б — биотнн; СА— стрептавиднн; ЩФ вЂ” щелочная фосфатаза. Микробиологическое производство лекарсгвенных средств 20! примерно 400 нуклеотидов, с помощьк1 которого ДИК-зонд связывается с заранее отмсчешюй точкой на найлоновом фильтре, а остальная его часть остается свободной и может гибрцдизоваться (рис.
9.!2). Сегменты тестируемой ДНК, каждый из которых включает по одному из возможных мутациопных сайтов, олповрсменпо амплифицируют с помощью ПЦР, причем один праймср из каждой пары на 5'-конце помечен биотигюм. Амплифицирова1шыс фрагменты ДНК-мишени гибридизуют с зондами, пришитыми к Ф1шьтру, в условиях, обеспсчива1ощих гибридизацшо только полностью комплемснтарных последователы1остей. В гибридизационную смесь добавляют стрептавидин, связанный с щелочной Фосфатазой (можно также использовать псроксидазу хрена или уреазу). После гибридизации промывают фильтр и добавляют нсокрашенпый' субстрат.
Если имеет место полное соответствие межЛу амплифицнроваппым сегментом ДНК-мишени и специфическим олигонуклеотидным зондом, то на фильтре появится цветная точка. На один и гот жс фильтр можно нанести несколько точек, соотнзетству1ощих целому ряду разных специфических олигонуклеотидпых зондов.
Проанализировав эту цветную мозаику, можно идентифицировать один из многих возможных сайтов мутации. ПЕРСПЕКТИВЫ Молекулярная диапюстика — это быстро развивающееся направление. Хоти его основные принципы уже сформировались, технические летали отдельных тестов могут различаться.
Для получения в лостаточном количестве ДНК-мишени сейчас успешно применяют ПЦР. Использование ПЦР и специфических зондов существенно повышает чувствитслыюсть тестов и позволяет применять перадиоактивныс хромогснныс, хемилюмннссцснтные и флуоресцентные системы регистрации. Во многих случаях лля выявления мутации или экзогсппой ДНК инфекционного агента в исследуемол1 образце лостаточпо провести ПЦР с последующим элсктрофоретическим разделением продуктов Нс вызывает сомнения, по с помощью ДНК-диагностики можно будет выявлять большинство, а возможно и все наиболее распространенные ге- петические и инфекциош1ые заболевания, а также новообразования.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Лк1бой эффективный диагностический тест должен быть: 1) высокоспецифичным в от11ошении молекулы-мишени„2) достаточно чувствительным для выявления небольших количеств мишени; 3) достаточно простым, позволяющим бсз труда получать однознач1 1ыс результаты. Существуют два типа методов молекулярной диапюстики: один основан на сродстве антитела к конкретному апгигену, другой — на идентификации специфических нуклсотилных последовательностей с помощью гибридизации или ПЦР. Наибалес распрострацс1 п1ым иммунологнчсским методом является Е(1ВА.
Вкратце он состоит в следующем: 1) фиксация образца па тверлой подложке; 2) добавление первого антитела, специфичного к антигену-мишени, и его связывание с аптигеном-мишенью; 3) добавление копьюгата второе а1ггитело — фермент, который присоединяется к первол1у антителу; 4) добавление неокрашенною субстрата, который под действием фермента, входящего в состав копъюгата, превращается в окрашенное соединение. Изменение цвета реакпиошюй смеси свидетельствует о присутствии в образце молекулы-мишени.
ЕЕ)ЯА применяется для обнаружения различных белков, идентификации вирусов и бактерий, а также определения 11изкомолскулярных соединений в широком спектре биологических образцов. Чтобы повысить специфичность первых антител, для диагностики часто используют мопоклональпыс антитела. При этом для уменьшения стоимости прибсга1от к технике клонирования их фрагментов в Е. со!1' и получают комбинаторную библиотеку, а на ее основе — широкий спектр комбинаций Гв-фрагментов. Высокоч~ вствителы1ым и специфич11ым методом обнаружения нуклсотидных последовательностей в биологических образцах является гибридизация.
Его использовали при разработке способов идентификапии патогенных микроорганизмов в клинических образцах и различных микроорганизлюв в окружающей среде. 202 ГЛАВА 9 ДНК-диагностика основывается на об||аружении известных нуклеотидных последовательностей; для зтоп| синтезируют специфические нраймсры и амгшифицируют последовательность-мишень. Жо позволяет использовать не- радиоактивные системы детекции (например, хсмилк|минссцентный метод) или регистрировать ГГЦР-продукты методом гель-электрофореза.
Кроме того, ПЦР-продукты можно пометить флуоресцентным красителем, присоединив его к 5 -концу праймера. В судебной медицине все более широкое применение находит метод геномной дактилоскопии, основанный на том, что ДНК кажлого чсловека образует уникальный набор гибридизационных полос. При этом в качсствс зондов обычно используют минисателлитныс ДН К человека, которые не кодирую~ никаких белков и Отличак|тся Высокой вариабельностьк|. Для характеристики ДНК растений используют набор произвольных олигонуклеотидных праймеров, проводят ПЦР-амплифицикацик| случайных фрагментов ДНК, осуществляют злектрофорсз и получают специфичный для кажлого растения набор полос ДНК; данный подхол носит название КАРР.
Методы ДНК-диагностики применяют также для обнаружения точковых мутаций в данном |сне. Один из подходов заклк|частся в лигировании двух олигонуклсотщ|ных праймсров. При несоответствии всего одного нуклсотида в месте стыковки |ибридизовавшихся олигонуклсотидов лигирования нс происходит. ЛИТЕРАТУРА Вагапу Р. 1991. Сйп81с-ппс!со|Ыс йепсбс йвеавс дс|ес|юп пз!п8 с!Оде|! |ЬегшоагаЫС ййазс. Р«ос. 1991 М(ат( В(о/Тесйло(. (Илге«Вутр, 1: 88. Вагйег К. Н., 1 Япейяаепй, |т'. Воопеу, С.С.
А1еспв, И. т'. 1)овгайо„П. Е. ЪУ)гй|. 1986. 8рсс!Ис Гз)'~А ргоЬС Гог Гйе с(!яйлов!в ОГ Р1а|тогйит (а(пра«ит ша1апа. 5!тенге 231: 1434 — 1436. Выйа|тап Т. Е., К. К. Яа)к), С. Н. Еетепаоп, й. М. 'й'а|я|в, Н. А. Егйсй. 1988. ТЬе пзе оГ попгайоасл!Ке оИ8оппс!ео|К1е ргоЬев |о апа1ухе епаушабса1!у а|прИбед ГлчА Гог ргепа|а1 д!а8поз!з апд Гогепйс НГА |урш8. В!о/Тесйло(ойу 6: 943 — 947. Саг)воп Т|. Р., С. Бпрегко, Л. Масйеу, М.
Е. Сая1о!1, Р. Иапаеп. 1990. Сйегп!1нпппея-сел| де|есйоп оГ ппс1ек асЫ ЬуЬпйтайоп, Росах 12: 9 — 12, Саакеу С. Т. 1987. Б!зсаве г!!айпоз|з Ьу гесошЬ|- пап| Г)ХА ше!Ьог!я. Яс!еле« 236| 1223 — 1229. СЬейаЬ Е Р., 1'. %. Кап. 1989. Псгссг!Оп оГзрес|Т|с ГПМА зейпспсея Ьу Впогсясепсе ашр1|ссаоо: а со!ог сошр!ешсп|айоп вяза)с Р«ос. А(а(!. Асад. Вс|. ЬЖ4 86: 9178 — 9182.
1)ебепйав Р. С. 1992. РгоЬ!п8 Ыепг!гу: |Ье сйап8- |п8 Гасе оГ Г)ХА Г|п8егрг!и!!пй. Т«елдз В|аесслл!. 1О: 96--102. Ег1кЬ И. А., Г). Сейапй, Л. Л. Яп!паву. 199! . Кесспг а|)тапссз |п Гбе ро1угпегаяе сйаш геас|юп. Юс!елее 252: 1643- 1651. С!11ав 1. С. 1987. Ь(оп-гайоасг!Ке ргоЬсз Гог зрес|бс Г)ХА яег!Кепссв. Т«елдг В(о(есйло(. 5: 332-334. Наг!Ккее«1 К.
А., М. х'. 1... !)е Ч(11, Р. К. К1агаег. 1989. Ро!угпсгаяе сЬа|п гсасйоп Гог |Ье де|есйоп ог Мусобас(е|дит 1ер«ае. Х Сел. Ч!с«ойо!. 135: 2357-2364. Лей;геуа А. Л., А. МасЕео|1, К. Тавай(, 1). 1.. Ь(е11, Г). С. МопсМоп. 1991. МЬ~!ваге!Иге гсреа| со|1- ш8 аз а йййа1 арргоасЫо Г)!(А |ур|п8. А(аги«е 354: 204 — 209. К!пйяйвгу Г).
Т. 1987. !3ХА ргоЬез 1п й|е йайпоя|а оГ 8спс|к апг! шГсс|юпъ йьсаяса. 7«елдз В|о(еслло(. 5| 107 — 111. К)етап 1., С. СеЬеуейп. 1990. Вюйпу!а|од пис!со|Ыев Гог 1абсйп8 апг! г!е!ес!!п8 ПХА. Ме(йодз Елгуто(. 184: 561 — 577. Ко)йег С., С. М1!я!е)п. 1975. Сопгйюопа спршгев оГ Гцвсг! се1!в зссгсйп8 апйЪоду оГ ргсг!Сйпег! ярсс!Г|с!гу. (уа(и«е 256: 495 — 497. Квррпя|таву М. Х., Л. ЪУ. Нойвапп, С. К. Каярег, Я.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
