Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 58
Текст из файла (страница 58)
н В квжвом слрчвв испол зовго<ся олин из няиболес сильных <<роми<пров, «рвботвюгггг<х» в лвнной системе. Альеинао<-лииза ДНКаза 3 Наиболсс <<<етым легальным наслсдст<гспным заболеваггием среди европеоидов является муковисцидоз. В США выявлено 30 000 случаев этого заболевания, в Капвдс и странах Европы — 23 000. Пациенты с муковисцидозом часто страдают инфекционными заболеваниял<и, поражающими легкис.
Лечение рецидивирующих инфекций антибиотиками в конце концов приводит к появлени!о резистентных штаммов патогенных бактерий. Бактерии и продукты ихлизиса вызывают накопление в легких вязкой слизи, з прудняюшей дыхание. Одним из компонентов слизи является высокомолекулярная ДНК, которая высвобождается из бактериальных клеток при лизисе. Ученые из биотехнологической компании Оепеп(ес)< (США) выделили и экспрсссировали геп ДНКазы — ферменгл, который расщепляет высокомолекулярную ДНК на более короткие фрш менты.
Очищенный фермент вводят в составе аэрозоля в легкие больных муковисцидозом, он расщепляет ДНК„вязкость слизи снижается, что облегчает дыхание. Хотя эти меры и не излечивают муковисцидоз, они облегчают состояние больного. Применение данного фермента было недавно одобрено Департаментом по контролю за качеством пищевых продуктов, л<едикамснтов и косметических средств (США), и объем сто продаж составил в 2000 г. примерно 100 млн. до паров. Альгинат — это полисахарид, синтсзируемый целым рядом морских водорослей, а также по <- венпыми и морскими бактериг<ми. ЕГО мОИО- мерными единицами являются два сахарида— )3-О-маннуропат и О<-1:гулуронат, относительное содержание и распределение которых и определяют свойства конкретного альгината.
Так, остатки <2-1.-гулуроната образуют межцепочечные и внугрицепочечпыс сшивки путем связывания ионов кальция; остатки )3-Г)-л!аннуроната связывают ионы других мстш!лов. Альгинат, содержащий такие сшивки, образует эластичный гель, вязкость которого прямо пропорциональна размеру полисахаридиых молекул. Выделение альгипаш слизистыми ппаммами Рыиг(отопал оегирг<оло существенно повышает вязкость слизи у больных муковисцидозом. Чтобы очистить дыхательные пути и облегчить состояние больных, в дополнение к обработке ДНКазой 1 следует провести деполимеризацию альгината с помощью альгипат-лиазы.
Геп альгинат-лиазы бьп выделен из Р(аго!)ос!спи<я зр., грамотрицательной почвенной бактерии, ативно вырабатывакнцей этот фермент. На основе Е'. со)! был создан банк клонов Исрп<гостев<ил< и проведен скрининг тех пз них, которые синтезируют алы инат-лиазу, путем высевания всех клонов на твердую среду„содержащую альги наг, с добавлением ионов кальция.
В таких условиях весь альгинат, находящийся в среде, за исключением того, который окружает продуцирующие альгинат-лиазу колонии, образует сшивки и становится мутным. 1"идролизованный альгинат теряет способность к формированию сшивок, поэтому среда вокруг синтезирующих альгинатлиазу колоний остается прозрачной. Анализ клонироваиного фрагмента ДНК, присутствующего в одной из положительных колоний, показал наличие открытой рамки считывания, кодируюп<ей полипептид мол. массой около 69 000.
Более детальные биохимические и 210 ГЛАВА 1О Гх-конец 6 кда С-конец 23 гДа Депщщмерязует вльгинвт бактерий и альгапвт морских водорослей Депслимервзует вльгвнат бактерай Деполимсризует вльгапвт морских волорослей Рис. 10.3. Процессинг белка — предшественника рскомбинантной альгинат.-лиазы Ь)агоЬасгег!игп, пронсхолящнй в Е. сей. В результате отщсплення от белка мол.
массой 69 кДа псптида 6 кДа образуется белок люл. массой 63 кДа, способный де!юлнмсрнзовать альгинат морских волорослсй н бактериальный альгннат Расщепление белка 63 кДа дает белок мол. массой 23 кДа, активно леполнмеризующнй альгина| морских волорослсй, н белок мол. массой 40 кДа, г!щролнзующий бактернальный альгинат. Моноклональные антитела как лекарственные средстна Примерно ! 00 лет назад была предпринята попытка лечения детей, больных дифтерией, с помощью неочищенной антисыворотки, получсн- Пеннцнллиназный Сегмент, коггнруюп!ий промотор сигнальный пептлл а-амалазм Колируюпгая последовагсльность Рис.
10.4. ДНК, кодирующая альпшаг-лиазу мол. массой 40 кДа. К последовательности, копирующей И-канах! альгинатлназы, присоединен сегмент гена а-ггхгилазьг В. зиЬЯй, кодирующий се синодальный пептнд. Транс- крипция контролируется при 1!омон!и системы зкспрсссин гена псннцнллиназы В. яи1иг!цс гене!ические исследования показшпи, что этот полнпептид, по-видимому, является прслшествснником трех альгинат-лназ, вырабатываемых Г(игоЬисгеггигл зр.
(рнс. 10.3). Сначшга какой-то протеолитнческнй фермент отрезает от него Х- концевой псгпнд массой около 6000. Оставшийся белок мол. массой 63 000 способен дсполнмсризовать альгннат, вырабгггываемый как бактериями, так и морскими волорослями. При его послслующсм разрезании образуется пролукт мол. массой 23 000, дсполимсризуюгпий альгинат морских водорослей, н фермент мол. массой 40 000, разрушагощий альгинат бактерий. Длл получения больших количеств фермента мол.
массой 40 000 кодирующую его ДИК аыг!лифицгировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), а затем встраивали в пьшслспный из В. лиЬ!!1!з плазмидпый вектор, несущий ген, кодирующий сигнальный псптид а-аьгилазы В. зиЬп!ис Транскрипцию контролировали при помощи системы экспрессии гена пснициллиназы (рис. 10.4). При трансформации клеток В. аиЫВЬ полученной плазмидой и вьюевании их на содержащую альгинат твердую среду с лобавлснием ионов кальшгя образовались колонии с большим ореолом. Когда такие колонии выращивали в жндкой среде, рекомбинантная альгинат-лиаза выделялась в культуральную среду.
Последующие тестьг показали, что этот фермент способен эффективно разжижать алы-ипаты, синтезирусмыс слизистыми штаммами Р. пегая(пота, которые были выделены из легких больных муковисцидозом. Для тог о чтобы определить, целесообразно ли проводить клиническое тсстироваг!нс рскомбинантной альгинатлиазы, нужны дополнитсльныс исследования. Микробиологическое производство лекарственных срслс! в 21! ной от лошадей, которых инфицировали Со!у!!с(иаСГегиит 5(ир)ит)!ее!а!5 ВЫЗЫваюипсй Диифтсрию у человека.
С. г(ир555)!ее!ее инфищируст горло и миндалины, выделяя экзотоксин, приводящий к гибели клеток чсловска. Проникая в кровоток, этот токсин !Юражаст органы, удалснныс оз места первичной инфекции, и в отсутствие лечения болезнь может иметь летальный исход. (В тс врсмсна, о которых идет речь, смертность достигала 45%.) Однако, если больному в первые несколько дней после начала инфскции ввести лошадиную антисыворотку, содержащую аниптсла к этому экзотоксину, то у него возникнсз пассивный иммунитет, который позволяет избежать летального исхода. К сожалению, риск, связанный с исполщованисм антител, нс позволяет пиироко применять этОт мстОд зс(иапии.
ДслО В тОм, ЧТО В Ор! Внизмс больного часто вырабатываются собствснныс антитсла на чужсродныс бслки, присутствующие в цельной или частично очищенной антисыворипкс, и сс повторное введение в случае сснсибилизации организма может привести к развитию анафилактичсского шока и гибели папнспта. С развитисм гибридомной технологии вновь появилась палсжда на тО, что антитсиш мОжнО будет использовать в качестве зсрапсвзичсских средств для поддержания постоянного уровня чистых моноспсцифичных антител в организме. Однако остаются проблемы, связанныс с риском развития перекрестных реакций, приводящих к развитиио иммунного ответа и анафилаксии: ведь в ор! анизмс больного могут вырабатываться собствснныс антитела на дстсрминанты моноклональных антител мыши.
Поэтому основная задача в настоящее время состоит в том, чтобы разработать методы получения моноклональных антител человека, обладающих как спсцифиичсскими иммунотсрапсвтичсскими свойствами, так и пониженной иммуногсшюстью. Структура и 515ункиии аитител Молекула антитела (иммуноглобулин) состоит из двух «легких» (1.) и двух «тяжелых» (Н) белковых цепей, которые соединены волоролными связями и расположенными в строго определенных местах дисульфидными мостиками.
Х- концевые участки 1= и Н-пспсй образуют а5пигснсвязываюший сайз. Отдельные домены (области) молекулы антитела выполняют разныс функции, что облсгчасз манипуляции с генами антитсл (рис. 10.5). Антигснсвязывающис сйЁты состОят из трсх участкОВ, Опрсдсл5НОших комплсмснтарность аипзпсл к антигсну (С(уй, от англ. Соипр1списп!Впгу-с)с!Сгш(пипа гсяиопв), и образукпцих вариабсльныс (55Н и 5'„) области на Х-копнах Н- и 1-испей. Для СО(( характерна очень высокая изменчивость послсдоваисль5иости аминокислот, поэтому их сшс называют гипсрвариабсльными. Помимо вариабсльных (игн и 5' ), каждая 1.-цепь содержит одну констагизную область, или домен (С,), а к!ока!в! Н-цспь— з(зи констаипниих облает~, или домена (С5„, Сн! и Си,).
При обработкс антитсла протсолитичсским фсрмснзом папаином образуются три фрагмснза: два идентичных (ГаЬ), каждый из которых содсржнз интактную 1 -цепь„связанную дисульфидным мостиком с Ъ5Н- и С и-домснами Н-цепи, и один Гс, состоящий из двух соединенных дисУльфиднои свЯзью ( нз- и Снз-домснОВ Н-цспи.
ГВЬ-фра5мснт, точнее его Ы-концсва5! часть, называемая Гч-фрагментом, обл таст антигснсвязываиощсй активностью, присущей интактной молекуле антипсла (рис. 10.5). При этом сто амннокислотная последовательность у разных молекул существенно различастся. После связывания антигсна с интактным антитслом запускаются следующие рсакции иммунного отвез а. ° Активируется система комплемента.
Компоненты этой системы разрушают клсточнью мембраны, активируют фагоциты и генерируют сигналы, мобилизующие другис компоненты системы иммунного ответа. ° В результате связывания Гс-участка анз итсла с Гс-рсцсптором эффскторной клетки запускается рсакц!ия опосредованной антитслами клеточной цизотоксичности. Активированная эффскторная клетка высвобождает вещества, лизируюшис чужеродную клетку, с которой связан ГаЬ-участок молекулы антитела.
° После связывания ГаЬ-участка с растворимым антигоном Гс-участок антитела может присоединяться к Гс-рсцспторам иЬагоцитов, которые захватывают и разрушакп комплекс антигсн — агп итсло. 2!2 СЛАВА !О Про4илактика отторжения трансплантированных органов В 1970-х гг. были пересмотрены взгляды на пассивную иммунизашию: сс стали считать профилактическим средством борьбы с отторжением трансплантированных органов.
Предлагалось вводить пациентам специфические антитела, качор!яе будут связываться с лпмфоцитами определенного типа, уменьшая иммунный ответ, направленный против пересаженного органа. Первыми веществами, рекомснлованпыми Департаментом цо контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (США) лля использования в качестве иммуносупрессоров при пересадке органов у человека, были моноклональпые антитела лп !- ши ОКТЗ. За отторжение органов отвечают так называемые Т-клетки — лимфоциты, дифференцируюшисся в зимусс. ОКТЗ связываются с рецептором, находящимся на поверхности любой Т-клетки, который называется СОЗ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
