Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 61
Текст из файла (страница 61)
кДНК одной Н- и одной 1 -цепи встраивают в общий «комбинаторный» вектор, так что в бактериофаге синтезируются обе цепи и образуется «полноценный» Гу-г)грагмент (рис. 10.!3, г)). Микробиологическое производство лекарственных средств 219 Вылсаеннс мРНК нз изолироааиных лимфацнтаа Синтез кДНК на мРНК ПЦР-ампзифихацю~ ДНК Н- я 1:цепей Рестрикция специфичными пес грпцирующимя знаонуклеазами ВстраиааниедНК Н-цепи ВстраиааниеДНК Ь-цепи а геном в геном .
Н-цепсчечнсгп» г.-цсппчечнспэ» бактериофащ бактерисфага Объединение ДНК Н- и 1.-цепей а одном векторе Скрипнпг бляшек лля аыяаления антнгенсаязыаающей акгианости Вырезание плазмнаы, солержащей фрагменты ДНК, кслирующээе Н- и 1;цепи трансформация Е. еа1г сконструирпаанной плазмиаой, сплержзглей ДНК Н- н 1:цепей Выделение антигенсаязыаающего Гт-фрагмента нз Е, гп11 Рис. 10.12. Создание с помощью Е сод комбинатор- ной библиотеки кДНК Ч,— и Чп-областей антитела.
На этапе соединения кДНК Н- и 1-цепей в одном векторе образуется широкий спектр генов различных антител. Некоторые из них кодируют уникальные сайты связывания, получить которые с помощью обычной гибридомной технологии было бы невозможно. Пул антител млекопитаюгцих включает 10ь — 10з разных антител.
Фаговая библиотека содержит примерно столь- ко же клонов, поэтому можно ожидать, что одна комбинаторная библиотека будет вырабатывать такое же количество различных антител (Еу-молекул), как любое млекопитаклцее. Кроме того, однажды создав исходную комбинаторную библиотеку, можно комбинировать 1.— и Н-пепи н получать Еу-фрагменты, распознающие необьэчные эпитопы. Вще большего разнообразия можно достичь, используя неспецифический мутагенез. Поскольку за относительно короткое время можно провести скрининг миллионов фаговых бляшек, илентификапия Еу-фрагментов с нужной специфичностью занимает от 7 до 14 дней, Для сравнения: скрининг нескольких сотен гибрпдомных клеточных линий обычно занимает месяцы.
Векторы на основе бактериофага ) не очень пригодны лля получения больших количеств белковых молекул. Чтобы решить эту проблему, сконструировали такой вектор, в котором ДНК Н- и !=цепей встраиваются в сайт, фланкированный плазмидной ДНК. Такую плазмиду, содержащую ДНК Н- и 1.-пепи, можно вырезать из векюра и трансе)юрмировать ею Е. год (рис. 10.12). Являясь частью гала змиды, ДН К Еу-фрагментов будет многократно реплицироваться в клетках Е год с образованием большопэ количества продукта, который можно использовать как в диагностических, так и в терапевтических целях. При созлании комбинаторных библиотек вместо фага 2, можно использовать нитевидные бактериофаги М13 или Ы (рис.
10.14). В этих случаях соответствующий фрагмент антитела синтезируется как часть химерного белка, локализованного на поверхности фаговой частипы. Скрининг комбинаторной библиотеки фрагментов антител можно провести при помощи ферментного иммуносорбентного анализа (Е(.1ВА). Суть метода состоит в следующем: образцы (аликвоты) из библиотеки поме1цают в ячейки планшеты, содержащие антиген-мишень.
Ячейки промывают, чтобы удщэить несвязанные фиговые частицы. В каждую ячейку вносят конъкпат, состоящий из антитела, связываюгцегося с белком фаговой оболочки, и фермента. Ячейки промывают лля улаления несвязанного конъюгата и добавляют в каждую из них хромогенный субстрат, который расгцепляется ферментом, связанным с фатом, и окрашн- 220 ГЛАВА 1О А асан! л вг! д Фог! и лгог! Ест~К! мог! Сигнальный Сигнальный р!.ас ССР пептил Фрагмептц!!К и-цепи ССР пептид ФрагмснтДНК !.-пепи Рис. 10.13. Сконструированные участки ДНК из комбинаторной биги!потеки кЛНК Ру-фрага!ента, клонированные в бактсриофаг а.
А и Б. Фрагменты ДНК 1.-(А) и Н-(Б) цепей раздельно встроили в векторы на основе бактериофага а. Е. Провели рестрикцию кажлой Есой!-бибтлиотеки и лигировали фрагменты ДНК из библиотеки Н-цепи с фрагмешвми ДНК из библиотеки (-цепи, в результате чего получили комбина горную библиотеку, содержащую все возможныс сочетания фрагментов 1.- и Н-испей с экспрессией соединенного фрагмента в одном векторе. р(ас — !ас-промотор Е со!г, ССР— саит связывания с рибосомой. вает те ячейки, в которых находятся фаговые частицы, несущие антитела к антигену-мишени. Процесс отбора и последуклцая очистка бактериофагов, синтезирующих фрагмент антитела, специфичный к нужному антигону, в этом случае ! ораздо про!це, чем тогда, когда проводится подсчет бляшек бактериофага Х. Выделив фаг, синтезирующий желаемый фрагмент антитела, можно экстрагировать кодирующую этот фрагменз ДНК и субклонировать ее в экспрессирующем векторе.
Разные варианты антител с повышенным сродством к антигену-мишени можно получать замещением фрагментов ДНК 'г! - и Ън-областей или с помощью неспепифического мутагенеза. Разработав метолы получения Ру-фрагментов, исследователи попытались определить, способна ли о!дельная белковая цепочка, состоящая только из Ъ'! — и Ъ', -доменов, образовать функциональную молекулу, связывающую антиген. Компьютерное моделирование трехмерной сгруктуры предполагаемого одноцепочечного антитела показало, что для образования конформации, необходимой лля связывания аптигсна, гг! — и ггн-домены должны быть разделены линкерным пептидом.
Имея это в виду, Ъ'г- и Нн-ДНК, синтезированные на кДНК- матрице клонированного моноклонального антитела, присоепннили к химически синтезированному ДНК-линкеру, создав конструкцию ~'„-ДНК вЂ” линкер. -тгн-ДНК. Соответствующий одноцепоче!ный белок синтезировали в Е го)г', очистили и обнаружили, что его сродство и специфичность к антигену сходны с таковыми интактного моноклонального антитела.
Гадим образом, с помощью Е соб можно без труда получать функциональные однопепочечные ангнтела. Одноцепочечные антитела могут найти широкое применение в клинике в тех случаях, когда проявление Рс-эффекторных функций не является необхолимым, а малый размер молекулы (мол, масса одноцепочечного антитела составляет примерно 27 кДа, а иммуноглобулина Π— 150 кДа) дает определенные преимущества.
Кроме того, к одноцепочечному антителу можно присоединить последовательность, кодирую!цую тот или иной белок, получив бифункпиональную молекулу, которая сможет связываться с опрелеленной мишенью, проявляя при этом специфическую активность. Микробиологическое ироизнолстно лекарственных средств 221 кДНК !.-цепи кДНК Н-цепн !П!Р ~ ПЦР М Ланнер У, : Е:Л >1 3!анкер Упаковка иолнфицнронанцон фагонойдНК н Фаг М!3 нкер — Ун Был проведен также еще один эксперимент: вместо того чтобы соединять Ч,- и Чп-цепи коригким пептидом, аминокислоты каркасной области модифицировю!и таким образом, чтобы между ними образовывался дисульфидный мостик.
Эффективность такой стабилизированной лисульфидной связью Гу-молекулы, связанной с токсином, разрушающим раковые клетки, сравнили с эффективностью одноцепочечной Гу-молекулы, связанной с тем жс токсином (рис. 10.15). Обнаружилось, что стабилизированный дисульфидной связью и одноцепочечный Гу-иммунотоксины обладают одинаковой активностью и специфичностью, но первый в несколько раз стабильнее. Можно предположить, что в какнх-то ситуациях с! абилизированные Гу-молекулы могут оказаться предпочтительнее одноцепочечных Ги-молекул. Лннкерный цеигнл Днсульфнлиан связь Рис. 1й.14. Создание комбинаторной библиотеки кДНК Гг-фрагментон антител с помона*к! нитевидною бактеригх)гага М)3.
кДПК Ч,— и Уи-областей амилифипиронали методом ПЦР, а затем лигиронани. исиолыуя ДНК короткого линкерного иситила. Полученные фрагмензы ДНК, составляющие комбииаторную библиотеку кДНК олг!ог!спичечных антител, встроили н геном фа! а М!3 с присоединением их к фагоному гену 3, который кодирует ионерхностный фагоный белок. В М!3 с гена 3 сгг!псзирустся три белковых молекулы, поэтом> кажлый рскомбинантный фаг М13, содержащий комбинатора»ю библио!еку кДНК оиноиеиочечных антител, будет нести три молекуль! химерного белка, состоящего из продукта гена 3 н одноиеиочечного ан пиала. Ряс. 10.15. Схематическое изображение одноцеио- чсчного Гг-иммуногоксинн (А) и Гг-ик!мунотоксина, стабилизированного дисульфидной связью (Ь). 222 ГЛАВА !О вич СР4 !'н-кдсска мерный мнлскс Р4-токсин ар!20 Лекарственные средства против Вич Ученым пока не удалось получить вакцину, достаточно эффективную против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), который вызывает развитие синдроли приобретенного иммунодефщ!ига (СПИД).
Параллельно с созданием такой вакцины идет поиск Лругих средств, позволяющих замедлить патологический процесс. ВИс! поражает один из видов лимфоцитов, а именно Т-хелперы (Тн-клетки). В норме в процессе развития иммунного ответа Тн-клетки связывают продукты леградации специфических антигенов и высвобождакзт факторы, стимулирующие другие клетки иммунной системы к участию в иммунном ответе.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
