Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 65
Текст из файла (страница 65)
Затем ее расщепили с помощью рестрицирующих энлонуклеаз и клопировали полученные фрагмечгп,ч в экспрессирующем Е. го(гэвекторе. Продукт кодируюпчей последовательности НР! -геца идеш ифицировали иммунологическими методами как часть слитого (химерного) белка, синтез которого копч ролируется системой р -промотор — с1-репрессор. Белок состоит из 39б амипокислотных остатков, содержит часть молекулы репликазы бактериофага МЯ2 и гюлноразмерный НР1-белок РМОН, благодаря чему он и индуцирует выработку нейтрализуюших РМ ОН антител. Получить разрешение на применение вакцины, содержащей химерный белок, очень трудно, поэтому, вероятно, придется субклонировать НР1-последовательность в другом экспрессгируюцгем векторе.
Так или иначе, субьединпчная вакцина против яшура скоро будет готова для проведения доклинических испытаний. Противотуберкулезные вакцаны Туберкулез — системное инфекционное заболевание, широко распространешюе во вселю мире. Его возбудителем являечся бактерия МусаЬасгепит гиЬеп и(охи. Она инфицирует разные ткани и органы (чаще всего легкие) и приводит к гибели клеток. У пациентов наблюдаются лихорадка, потеря веса, а в отсутствие лечения заболевание заканчивается смертью. По оценкам, этим патогенным микрооргапвзмолг инфицировапо около 2 млрд.
людей, а туберкулез ежегодно угюсит примерно 3 млн. жчгчней. Последние 50 лег для лечения туберкулеза использовали антибиотики, но уже появилось множество устойчивых к ним ппаммов М. гаЬеп и(гха(з, так что забоггевание, казавшееся побежденным, впогзь стало серьезной проблемой.
В настоящее время в ряде сгран в качестве противотуберкулезной вакцины используют один из ппаммов МугоЬаггеггит Ьоггз, бациллу Кальмета — Герена (ВСО, Бас!!1ца Са!шепе — Оибпп). Однако эффективность такого поггхода вызывает сомнения по двум причинам: 1) живые ВСС-клетки могуч вызвать серьезное заболевание у лиц со сниженным иммунным статусом (например, у больных СПИДом); 2) липа„которым ввели ВСО-вакцигчу, лают положительный ответ па обычную процедуру выявления вызывающих туберкулез бактерий, что не позволяет отличить их от больных туберкулезом. В связи с этим в некоторых странах, в том числе и в США, ВСО-вакцина к использованию не разрешена.
В попытках создания более безопасной и эффективной субъеднничной противотуберкулезной вакциньг были изучены иммунпопротективпые свойства очищенных внеклеточных белков М. гаЬепи(опж Из жидкой бактериальной культуры выделили и очистили шесть основных из 100 секретируемых белков, и каждый из них по отдельности, а затем различные их комбинации использовали для иммунизации морских свинок.
Животным вводилн в виде аэрозоля примерно 200 живых клеток М. габегсийззгз, что является для них весьма высокой дозой. Через 9 — 10 нед животных умерщвляли и исследовали их легкие и селезенку на предмет присутствия этой патогенгюй бактерии. При введении некоторых комбинаций очишенных белков потеря веса„ поражение легких и селезенки и уровень смертгюсти были такими же, как и при иммунизапии живой ВСО-вакциной. Теперь нужно провести сравнение эФфективности белков М. гиЬегсийгзгз, получешгых с помощью технологии рекомбинантпых ДИК„с эффективностью секреторных белков и разработать безопасную и эффекгивнук> вакцчину для профилактики туберкулеза у человека. Пентидные вакцины Далее возникает следукгщий вопрос: может ли небольшой участок белковой молекулы (домеп) служить эффективной субьедипичной вакциной и индуг!ировать выработку антител? Интуитивно кажется, что те домены, которые доступны 232 ГЛАВА! ! Мембрана Внутри Рис.
11.3. Обобщенный мембраносвязанный белок, внешние зпнтопы (! — 5) которого могут нндуцировать иммупный ответ. для антитела (т. е. те, которые находятся на поверхности нируса), обладают иммуногеннымн свойствами, а внутренние домены несущественны, если только они не влияют на конформапию пммуногешюго домена (рис. 11.3). Если это предположение верно, то короткие пептиды, имитирующие эпитопы (антигенные детерминанты), можно использовать для создания вакцин.
Имея все зпо в виду, синтезировали химическими методами домены ЧР! ГМПЧ н проверили возможность создания на их основе пептидпых вакцин. Каждый из пептидов, соответствующих амипокислотным остаткам 141 — 160, 151 — 160 и 200 — 213 С-когн!ело~о участка ЧР! и аминокислотным остаткам 9 — 24, 17 — 32 и 25 — 41 )ч-концевого участка, сшили по отдельности с инертным Короткие пептиды Рнс. 11.4. Короткие погонны, сшитые с белком-переносчиком и служащие основой пспзлдной вакцины, белком-переносчиком (гемоцианипом моллюска фиссурелни), чтобы предотвратить их разрушение, н ввели морским свинкам (рис. 11.4).
Синтез антзпел в количестве, достаточном для зашиты неплотного от последующих ГМ1)Ч-инфекций, наблюдался только при введении пептида 141 — 160. Внедепие же целого ЧР1 илн пептидов 9 — 24, 17 — 32 и 25 — 41 индуцнровало синтез антител в меныпих количествах. Более длинный пептид, состоящий из аминокнслотных остатков 141 — 158 и 200 — 213, которые были соединены лвумя пролиновыми остаткалпц индуцировал эффективный синтез антител у морских свинок даже в том случае, когда он не был сшит с белком-носителем.
Эта «днухпептидная» молекула оказалась эффективнее любого изолированного пептида и блокировала пролиферацию ГМ1)Ч у крупного рогатого скота и морских свинок. Эти результаты являются несыта многообеШиощими, однако количество (доза) пептидпого материала, необходимого для индукции иммунного ответа, примерно в 1000 раз выше„чем в случае убитой ГМ)3Ч-вакцины. Чтобы решить эту проблему, фрагмент ДНК, кодирующий пептид из аминокислотпых остатков 142 — 160 ЧР1 ГМГ)Ч, сшили с геном, кодирующим кбровый белок гепатита В (НВсА»). При экспрессии этого химерного гена в Е.
со)1 или культуре животных клеток его продукты — белковые молекулы — н процессе самосборки образовывали стабильные «27нм-частицы», па поверхности которых находился пептид из ЧР! ГМ)3Ч. Эти частицы обладали высокой иммуногенностью. Таким образом, Н ВсАя можно использовать в качестве эффективной молекулы-носителя синтетических поп пшон. Сравнение иммуногенности различных пептидпых ГМГЗЧ-вакцин, содержащих домен 142 — 160 ЧР!-белка, проведенное на морских свинках, показало, по иммуногенность химерного белка, состоящею из НВсАл н указанного домена, в 10 раз ниже, чем у инактивироваш пах ГМ)3Ч-частиц, в 35 раз вьппе, ~ем у химер> юго белка, содержащею !1-галактозидазу Е.
со)7 и домен 137 — 162 из ЧР! ГМ1)Ч, и л 500 раз вьппе, чем у свободного синтетического пептида, состоящего нз амипокислотных остатков 142 — 160. Поскольку синтетический поптид, спзитый с НВсАд, образует 27нм-частицы, сход- Вакцины 233 пые с вирусом гепатита В, и они обладают почти такой же иммуногепностью, как и интактный вирус, на основе которого получен синтетический пептид, этот подход может стать основным способом доставки пептидпых вакцин к месзу их действия. И все же существует несколько ограничений |~а использование коротких пептидов в качестве вакцин. ° Эпитоп, использующийся для создания эффективной пептидной вакцины, должен представлять собой короткий, но непрерывный участок белковой молекулы, а это бывает не всегда.
° Конформация пептида должна бьгп такой же, как у эпгп она в ип шктной вирусной частипе. ° Йзолированный эпигон может пе обладать достаточной иммуногепностью. В будущем синтетические пептидные вакцины могут стать аысокоспецифичной, относительно нелорогой, безопасной и эффективной альтернативой традиционным вакцинам, хотя для этого необходимо провесги еще немало исследований. Гснная иммунизация Новый подход, позволяющий индуцировать у организма иммунный ответ без введения агпигена, основан на включении в клетки животного-мишени гена, кодируюшего белок-антиген. В первых экспериментах такого рода Е. сойплазмиду, содержащую клонированный ген белка-антигена, транскрипция которого находилась под контролем промотора вируса животных, копьюгировали с микрочастьщами золота и бомбардировали ими клетки уха мыши.
Впоследствии выяснилось, что клонированную кДНК можно вводить в клетки и с помощью внутримышечной иньекцип раствора с большим количеством плазмиды, несущей соответствующую ДНК. Для этого необходимо в П)з — 104 раз больше ДНК, чем при бомбардировке микрочастицами. В одном из экспериментов более чем в 75% случаев ген включался в клетки мьппи, и синтезированный белок-антиген инду- пировал синтез антител. Этот полход позволяет избежать очистки аптитсна, что требует много времени и средств, или использования для соз- дания вакцины технологии рекомбипантных ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
