Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 68
Текст из файла (страница 68)
4. Проводят окончательный отбор с помощью ДНК-зонда, гибридизующегося с геном анти генного белка. Поскольку дефектные по тимидинкинизе ВКО спо44твггпо возникают с относительно высокой частотой (примерно 1 на 10з — 104 вирусных частиц), нередко проводят котрансфекцию клеток каким-либо селективным маркером и нужным геном. Это облегчает разграничение спонтанных мутантов и мутантов, полученных с помощью гомологичной рекомбинапии. В качестве селективного миркера обычно используют ген лео, кодирующий фермент неомицин-фосфотрансферазу П и обеспечивающий устойчивость к аналогу канимицина О-418. Этот ген, в отличие от других селективных маркеров, остается стабильным при всграивании в геном ВКО. Разработана специальная система, позволяющая избежать прерывания рамки считывания генов ВКО при встраивании чужеродною гена. При этом отпадает необходимость в использовании селективных маркеров, поскольку каждый образующий бляшку рекомбинантный вирус бу- ~лене р7.5 Мл ке ныв ген дет содержать и экспрессировать ген-мишень» ДНК ВКО дикого типа несет ген рр37.
ответндощий зи образование бляшек при росте вируса в монослойной культуре животных клеток (рис. 1!.10, А). Если заменить этот ген маркерным геном Е. сой, то образуется мутантный ВКО, который не формирует бляшки при выращивании его в течение 2 — 3 сут в кулыуре животных клеток (рис. 11.!О, Б). Ген-мншень вводят в этот мутантный вирус с помощью гомологичной рекомбинации его ДНК с вектором, несущим ген рр37 и ген-мишень (рис. П.10, 11). Мутантный ВКО, получивший ген рр37, приобретает способность к образованию бляшек„при этом в его геном встраивается ген-мишенгь а маркерный ген утрачивается.
Мутантный вирус с делетированным генол4 гр37не может ревертировать к дикому типу, поэтому каждая вирусная частица, образующая бляшку, содержит желиемун> конструкцию. Этот метод прост, применим для переноса и экспрессии любого гена-мишени, не требует каких- либо дополнительных маркерных генов и не прерывает римку считывания генов ВКО. В геном ВКО уже удалось встроить и зкспрессировать в культуре животных клеток несколько генов антигенных белков: О-белка ви- Рне. 11.10.
А. ДНК ВКО дикого типа. Д ДНК мугантного ВКО. В. Вектор на основе ВКО. Левый флаш н правый фланг — последовательности, примыкающие слева н справа сглттветственио к тену гр37 в ленокс ВКО дикого типа. Промшар гена 1р37не показан. р7.5 — сильный «ранний» (илн еиозлннй») ВКО-промотор. Ген-мншень встроен в полили|рнер. 1 омологнчиая рекомбниапня между рскомбннантиым вскторол4 н ДН К мутантнога вируса приводит к замене маркер- ного гена Е. сел на ген тр37 н геи-мишенг» Вакцины 24! 15 -5155 руса бешеншва, поверхностного антигена гепатита В, поверхностных белков вируса Синдбис, 1чР- и НА-белков вируса1риппа, )4- и С-белков вируса везикулярного стоматита, гликопротеинов вируса простого герпеса. Некоторые из полученных на основе ВКО рекомбинантных векторов можно использовать для создания эффективных вакпин.
Так, рекомбинантный ВКО, экспрессируюший ген гликопротеина П вируса простого герпеса типа 1, предотвращает герпесные инфекции у мышей, а рекомбинантный ВКО, экспрессирующий ген поверхностного антпгена вируса бешенства, индуцирует выработку протективных антител у лис, основных переносчиков вируса бешенства в Европе. Векторные ВКО-вакцины позволяют провести иммунизапюо сразу от нескольких заболеваний.
Для этого можно использовать рекомбинантный ВКО, который несет несколько генов, кодирующих разные антигены. В зависимости от используемого ВКО-промоп1ра чужеродный белок может синтезироваться в ранней или поздней фазе инфекционного цикла, при этом его количество определяется силой промотора.
Обычно для достижения высокого уровня экспрессии используют «поздние» ВКО- промоторы: р1! (промотор ге11а, отвеча1ощего за синтез белка мол. Массой 11 кДа) или рСЛЕ (промочор гена интегрального белка вируса коровьей оспы типа Л). При встраивании в одну ДНК ВКО нескольких чужеродных генов каждый из них помещают под контроль отлельного ВКО-промотора, чтобы предотвратить гомологичную рекомбинацию между различными участками вирусной ДНК„которая может привести к утрате встроенных генов. Живая рекомбинантная вирусная вакцина имеет ряд преимуществ перед неживыми вирусными и субъединичными вакцинами: 1) презентация аутентичного антигена практически не отличается от таковой при обычной инфекции; 2) вирус может реплицироваться в клетке-хозяине и увеличивать количество антигена, который активирует продукцию антител В-клетками (гуморальный иммунитет) и стимулирует выработку Т-клеток (клеточный иммунитет); 3) встраивание генов антигенных белков в один и большее число сайтов генома ВКО еще больше уменьшает его вирулентность.
Недостаток живой рекомбинантной вирусной вакцины состоит в том, что при вакцинации лиц со сниженным иммунным статусом (например, больных СПИДом) у них может развиться тяжелая вирусная инфекция. Чтобы решить эту проблему, можно встроить в вирусный вектор ген, кодирующий человеческий интерлейкин-2, который стимулирует Т-клеточный ответ и ограничивает пролиферацию вируса. Нежелательные побочные эффекты пролифе)зшВии ВКО можно предупредить инактивацией вируса после вакцинации. Для этого был создан чувствительный к инзерферону вирус (ВКО дикого типа относи1ельно устойчив к е1 о действию), пролиферацию которого можно регулировать в случае возникших при вакцинации осложнений. Механизм устойчивости ВКО к интерферону оставался неустановленным, пока не была обнаружена открытая рамка с ппывания К31., кодирующая белок мол.
массой 10,5 кДа. Этот белок содержит аминокислотную последовательность, гомологи*<ную !ч1-концевой части эукариозического фактора инициации е1Г-2а мол. Массой 36,1 кДа. !Ч-концевые области обоих белков содержат 87 практически идентичных аминокислотных остатков, причем в положении 51 в обоих случаях находится серии, который в е1Г-2а фосфорилируется активируемои интерфероном Р1-киназой, что приводит к ингибированию синтеза белка в обработанных интерфероном клетках. КЗ) -белок действует как конкурентный ингибитор фосфорилирования е!Г-2а, обеспечивая устойчивость ВКО к интерферону, и если из генома ВКО удалить ген К31 или его часть, то вирус станет чувствительным к интерферону.
С помощью ПЦР-мутагенеза гена К31., находящегося в составе гпазмиды, и последуюгцей гомологичной рекомбинапии между ДНК ВКО и плазмидой с целью замены КЗС-последовательности дикого типа модифицированным вариантом был сконструирован мутантный ВКО К31 . Этот штамм оказался в 10 — 15 раз более чувствительным к интерферону, чем штамм дикого типа (рис.
11.11). Эта работа является важным этапом на пути создания более безопасных ВКО-векторов. Последовательности, сходные с КЗ), могут содержать и другие устойчивые к интерферону вирусы, что позволит с помощью де- 242 ГЛАВА 11 — -« — ВКО дикого типа 10' 0 200 400 600 800 Интерферон, ЕДунл леций создавать их штиммы, чувствительные к интерферону. Большинство работ по созданию живых вирусных вакцин проводились на ВКО„однако в качестве кацдидатов на роль векторов для вакцинации рассматриваются и другие вирусы: аденовирус, полиовирус и вирус ветряной оспы. Вектор ни основе живого аттенуировинного полиовируси (его исследования только начинаются) привлекателен тем, что позволяет проводить пероральную вакцинацию. Такие «слизистые» вакцины (вакцины, компоненты которых связывшотся с рецепторами, расположенными в легких или желудочно-кишечном тракте) пригодны для профилактики самых разных заболеваний: холеры, брк>шиого тифа, гриппа, пневмонии, мононуклеоза, бешенства, СПИДа, болезни Лайма.
Но до любых клинических испьпаний любого ни первый взгляд безобидного вируса как системы доставки и экспрессии соответствующего гена необходимо убедитъся в том, что он действительно безопасен. Например, повсеместно используемый ВКО вызывает у людей осложнения с частотой примерно 3,0 10 е. Поэтому из генома рекомбинантного вируса, который предполагается использовать для вакцинации человека, желательно удалить последовательности. ответственные за вирулентносгь. Прогпивобактериальные вакцины Для лечения заболеваний, вызываемых бактери- ями, широко используются антибиотики, и лищь совсем недавно начались работы по созда- нию противобактериальных вакцин.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
