Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 66
Текст из файла (страница 66)
Кроме того, получаемые с его помощью белки с большей вероягностью подвергакпся правильной постгрансляциопной модифи кации, чем белки, синтезируемые оргапизмамихозяевами. Этот метод, полу ~ивший название генной иммунизации, можно использовать для вакцинации домашних жи вол ~ых. Перспективы генной иммунизации были тщательно изучены. В одной из серий экспериментов мьпнам в квадрицепсы обеих задних коне*шостей вводили раствор с Е сод-плазмидой, несущей кДНК нуклеопротеипа вируса гриппа А, транскрипция которой ~шходилась под контролем промотора вируса саркомы Рауса или цитомегаловируса.
Хотя уровень экспрессии гена нуклеопротеипа был настолько низок, что не поддавался ре~ истрации„через 2 нед после иммунизации в крови мьппей обнаруживались антитела к нему. Выживаемость иммунизированных мьппей оказалась значительно выше, чем мьппей из контрольной группы (рис. 11.5). Более того, они были нечувствительны и к друг ому штамму вируса гриппа. Такая перекрестная зашита не вглрабатывается при введении трыицпонных противогриппозных вакцин, полученшях па основе поверхностных антигенов вируса, и поэтому каждая вакцина специфична лппп к одному штамму вируса.
Более того, традиционные вакцины сохраняют свою эффективность только до тех пор, пока остакпся неизмененными поверхностные антигены, К сожалению, для генов поверхностных антигснов харакгерпа высокая частота мутаций, что приводит к появлению существенно различающихся штаммов вируса. Кбровые же белки, такие как нуклспротеин, относительно стабильны и активируют иммунную систему по другому механизму„чем поверхносгные апзигены.
ДНК-иммунизация позволяет не только избежать очистки белковых анппенов, но и индуцировать иммунный ответ„направлшшый именно на кодируемый плазмидой белок, а не па саму плазмиду. Поэтому один и тоз же вектор можно использовать для доставки разных белков или для многократного введения олного и того же гена. Судьба введенной в клетку ДНК точно неизвестна.
В принципе она может интегрировать в 234 ГЛАВА 1 ! 80 ж 60 Й 40 а 00 О 2 4 6 8 !О 12 Гя Время, сут геном хозяина с весьма серьезными последствиями, если при этом затрагивается какой-то важный ген или происходит злокачественная трансформация клетки. Однако такое развитие событий считается крайне маловероятным. Скорее всего такая ДНК какое-то время просуществует в клетке в виде нереплицируюшегося внехромосомного элемента, а затем разрушится. Генную иммунизацию )юка используют для выработки иммунитета к некоторым патогенным микроорганизмам (вирусу !риппа А, вирусу иммунодефицита человека типа 1, вирусу бычьего герпеса, вирусу бе!девства, ('(азтойит вр., вызывающему малярию, вирусу ге!!атита В) у животных, но не у человека.
Для облегчения доставки ДНК в клетки животных при проведении генной иммуниза!Зии был создан модифицированный пхгамм Я!|~е((а ()ехлеп'. Эта бактер!ия проникает в эпителиальцые кяетки животных путем фагоцитоза, и присутствующая в ней плазмидная ДНК попадает в цитоплазму клетки-хозяина, где и происходят транскригщия и трансляция переносимого ею гена, находящегося под контролем эукариотического промотора. Яще((а — это патогенный микроорганизм, и как таковой он не может использоваться для доставки ДНК.!.е пепатогепный пггамм можно получить, введя делению в геп азг(, кодирующий фермент аспартат-'р-полуальдегии — дегилрогеназу, кгжорый участвует в синтезе компонента клеточной стенки диаминоцимелиновой кислоты.
Штаммы с мутацией в Ряс. !1.5. Выживание мышей, иммунизированных вирусной ДНК. Тестируемых мьпнсй иммунизировали Е. сод-плазмилой„нссушей кДНК пухлеопротеипа вируса гриппа А под контролем промотора вируса саркомы Рауса. Контрольным мып!ам вводили только сглазмилпую ДНК. По оси абсцисс отлажено время, прошедшее п<юле контакта животных с вирусом гриппа. агпьгене растут только в присутствии диамипопимелиновой кислоты и их можно использовать для доставки плазмидной ДНК в эпитслиальныс клетки животных, поскольку они в них не пролиферируют. Эксперименты. в которых в качестве вектора для доставки ДНК в клетки использовалась 5(!((;еПа, были проведены па морских свинках, и хотя они оказались успешными, судить о безопасности данной системы можно будет лишь !юсле проведения клинических испытаний.
Огромным преимуществом этопз подхода является возможность перорального введения вакцин. Аттенуированные вакцины В некоторых случаях в качестве живых вакцин можно использовать тенет пчески модифицированные (рекомбинантные) микроорганизмы (бактерии или вирусы). Такие вакцины содержат либо непатогенпые микроорганизмы, синтезирующие антигенные детерминанты определенного патогенного агента, либо и!гаммы патогенных микроорганизмов, у которых модифицированы или лелетированы гены вирулентносги. В этих случаях основные антигенные детерминанты являются составными компонентами бактериальных или вирусных частиц и имеют такую же конформаци!о, какую они принимают в болезнетворпом микроорганизме.
Изолированный же антигеп часто утрачивает исходную конформа! !ию и вызывает лишь слабый иммунпый ответ. Вакпини > ° > Иммунизация с помощью пептида, синтезированного исходя из данньгх о нуилеотидной последовательности РНК вируса ящура 3.!.. В)гйе, К. А.
Ноцяйгеп, Н. А1схапг)ег, т М. Змпп)сй, 3. О. Зи!сйзрс, К. А. Се!пег, О..1. Ко)т)апик Р. Вга)тп Г>л)иге 298) 30 — 33, !982 эффективных и в тоже время мсцес дорогих вакцин, нс имеющих ограничений в применении. Введение вакцины инлуцируст выработку антител к анти)енныл! детерминантах), в норме присущтвующим на поверхности вирус) юй частицы. поэтому разумно было предположить, что аналогичный иммунный ответ могут вызнать короткие синтезичсские пе)пилы с такой жс аминокислгпной послсловательностью, как у вирусной антигеннай детерминанты. Конечно, такой подход прил)спим лишь втоц случае, ка>ла антигенная область прелсгаяляет собой короткий.
но непрерывный домен. Ьитгл и лр, вьщслили и охарактеризовали РНК вируса ящура и определили аминокислотну)о цослелавательность основного вирусного белка — ЧР1. 11ровеля теротоксин — это гексамерпый белок: он состоит из одной субъединицы А, которая обладает АОР- рибозилирукпцей активностью и стимулирует аденилатциклазу, и пяти субъедипиц В, которые специфи")ески связывая)тся с клеточным рецептором слизистой кище шика.
Субъединица А имеет два функциональных домена: А, „обладающий токсической активносгыа, и А, отвечающий за ее связывание с субъединицвми В. В настоящее время используется противохолериая вакцина„содержащая уб)пыс фснолом холерные вибрионы; она обеспечивает только частичную защиту от инфекции и лишь в течение 3 — б мес.
Поэтому были предприняты попьпки создать друг ие типы праги вохолериой вакцины. Как показали проведенные ранее исследования, субъединичная вакцина, содержащая ииактивированный холерный эптеротоксип, не приводиз к выработке полноцешюго иммунитета. Прг)т!гвохолерные викпины Живые вакцины, как правило, гораздо болес эффективны, чем неживые или субьединичные. Основное требование, предъявляемое к ним,— огсутствие в инокуляциоином материале вирулентпых микроор)вцизмов.
Это требование учитывалось и при создании живой противахолернои вакцины. Холера — быстро развивакяцаяся киц)ечцая инфекция, характеризующаяся лихоралкой, диарссй, болью в животе, дсгидратациен; передается через питьевую воду, загрязненную фекалиями. В развивающихся странах, где системы очистки воды и удаления сгочных вод недостмочпо развиты, угроза холеры вполне реальна. Возбудителем холеры является И!)г)г) с!)о)е>ае. Бактерия размножаезся в тонком кишечнике и вьщеляет в болыпом количестве эзггеротоксии, который и ответствен за патогенный эффект. Эн- Начиная с первой вакцины, созданной Джсннсром более 200 лет назал, болыпинства чсловсческнх противовирусныл вакпин салержали убитыс или атгснуированные автогенные вирусы или сходныс с ними нсцатогепныс ппаммы. Этот подход ласта)очно эффективен и цредотвращае! распространение ряла вирусных инфекций, однако его применение а)раничено ца ряду причиш не всс вирусы могут расти в культуре, 'по не позволяет созлавщь вакцины против них; производство традиционных вакцин — дорогостоящая и потспниально опасная процелура; не все вирусные заболевания можно предотвратить с помощью традиционных вакцин.
С развитием молекулярной биотехнологии вг)многих лабораториях б)ыли )цхдприпяты попытки созлания более безопасных и соответствующие >кспсрименты, они при)лли к выводу, что сп) антигенные лсзсрминанты нахала)- ся на (ч- или С-конце белковои молекулы. Опрслелив их аминокислотные последовательности, они синтезировали сори)о пептидов. которые сшили с бслкаминсреносчякамп и ввели кроликам. В ответ на им)гунн))анию С-концевыми пептидамн ЧР1 у кроликов и морских свинок вырабатывались антитела.
защищающие их от инфекции интакзпым вирусом ящура. Эта работа )юказала, что лля индукции синтеза антител, цейтрализующих интактные вирусные частицы, )юстаточно олного (или нескольких) домена (доменов) специфическо>о вирусного белка, и, следовательно, можно создавать вакцины попого типа, не солсржа)цие патогенных вир))сав. 236 ГЛАВА 11 Поскольку К сЬо!егое колонизирует слизистую кишечникз, разумно было предположгпь, что наиболее эффективной будет перорзльнзя противохолернзя вакцина. Имея это в виду, создали ппамм К сЬо7егае, из генома которого была делетировзнз часть кодирующей А,-пепзид нуклеотидной последовательности.
Этот штамм не синтезирует энтеротоксин, з потому не является патогенным и подходит для создания живой взкцины. Эксперимент состоял в следуюгцем В ген А,- пептида К с71о)егае был встроен ген устойчивости к тетрациклину. При этом прерывалась рамка считывания для А,-пептида, по штамм становился устойчивым к тетрациюгипу. В~ о нельзя бьшо использовать в качестве вакцины и потому, что со временем происходилз спсяпаннзя утрата тетрапиклинового гена, и синтез эптеротоксинз восстанавливался. Чтобы обойти эту проблему, создали штамм с дефектной нуклеотидной последовательностью, кодируюшей А,-пептид, которая не могла восстанавливаться (рис. ! 1.6).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
