Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 67
Текст из файла (страница 67)
Для этого использовали следуюший подход. Плзкзид, которая содержзлз сегмент ДНК, кодирующий А,-пептид, обрзботзли рсстрипирующими энлонуклезззмн С7а1 и ХЬа1, каждая нз которых рзсщеплялз только кодирующую А,-псптид последовательность вставки. 2. Чтобы замкнуть плззмиду в кольцо, к С)а1- сзйту пришили ХЬа1-лннкер и обработали плззмиду рестриктззой ХЬа1. 3. С помошью ДНК-лишзы фага Т4 соединили ХЬа1-сзйты плазмиды.
В результате из середины кодируюьцей А,-пентид носледовзтеллпосги оказался удаленным сегмент длиной 550 и. н., соответствующий аминокислгп ным остаткам 183 — 194. 4. С полюшью коньюгации перенесли эту плазмиду в штамм К сйо!егае, песуший геп устойчивости к тетрзциклипу в локусе, кодирующем А,-пептид.
5. В результате рекомбинации между оставшейся в составе плззмиды частью последовательности, кодируюшсй А -пептид, и геном А -пеп1 тидз, прерванным Теб-геном, кодирующая А,- пептид последов цельность в хромосоме была замешена гомологичпым плззмилным сегментом с делецией. 6. Внехромосомнзя плззмилз не могла долго существовать в холерном вибрионе и через несколько поколений была утрачена. 7. Отобрали клетки с интегрировзшюй дефектной А,-кодируюгцей последовательностью, испольт!я их чузютвителыюсть к тетрз1Шюти! 1уз Полученный таким способом стабильный штамм с делетированной кодирующей А,-пептид последовательностью не синтезировал актнвньш энтеротоксин и при этом сохранял все остальные биохимические свойства патогенной формы ~'.
сЬо)егае. Проводимые в пзстояшее время клинические испытания эффективности этой формы кзк противохолерной вакцины пока пе дачи однозначного результата. Вакцина обеспечивает почти 90%-ную ззшиту от холеры, но у некоторых испытуемых наблюдаются побочные эффекты. Возможно, понадобится изменить другой хромосомпый локус этого пп зммз, чтобы можно бьшо использовать его как вакцину. 7!ротивосешзионеллезпые вакцины Друтой способ получения непатогснпых штзммов, пригодных для создания нз их основе живых вакцин, состоит в удалении из геномз патогенных бактерий хромосомных облзстей, отвечающих зз независимгзе жизненновзжные функции. При этом лу ппе делетировзть по крайней мере две такие области, поскольку вероятность их однозреме1 и юго восстановления очень мала.
Предполагается, что штамм с двойной делецией будет обладать ограниченной пролиферзтивной способностью и сниженной пзтогснпостью, но обеспечит вырзботку иммунного отвсгз. Разные штзммы Яа)топе!!а вызывзют острые кишечные инфекции, постнатзльную инфекцию, брюппюй тиф, пищевую птксикоинфекцию. Для проФилактики всех этих заболеваний совершенно необходимо иметь эффективную вакцину. Чтобы получил зтгенуировзнные штаммы Ба!толе!!а, вносили делеции в гены аго, кодирующне ферменты биосинтезз аромзтических соединений, и в ге~ ~ы раг, кодируюгцие ферменты метаболизма пуринов. Тзкис ппаммы с двойной делецией вызывают легкую форму инфекции и обладают в !Оь раз меныпей внрулентносгью. Нз их основе уже созданы эффективные Вакцины 237 !! лвзмндв !!сслсдсввтсльнссть, коднруюшвя Аапсптнд С!с! Ис! |г.
ХромосомналДНК к свсуегие и слв! сс | ЛЪл1-л!зняср, ДНК-лннззв Фага тл Дслстнроввнняя асслсловлсльносзь Ген устоачнвссгн к тстрван клину рвкомбынвцня Хромосомная ДНК К сллзсглс Плвямндв 'з Дслстнраввнняя последовательность Рнс. 11.б. Созлание штамма К суза!сгас с лелецисй части нукяеотилной цослслозательности, кодирующсй А,-пептид холерного токсина. пероральные вакпины Лзш мышей, овен, круп- ного рогатого скота, цыплят, и совсем недавно— и для человека. Лротиволейш ианиозные вакцины Простейшие паразиты Ее!з7зтан!а тоже могут вызывать у челоаека развитие иммунного отве- та, однако создание эффективных вакцин про- тиа них прелставляет собой нелегкую задачу.
С этой целью можно использовать аттенуиронанные линии Х,е!у!!шаг!!а, но они часто реаертируют и становятся вирулентными, а кроме того, могут длительное время бессимптомно персистировать в организме человека — резервуаре инфекции — и передаваться другим люлям. Чтобы решить эти проблемы, попьпались создать атге- 238 17!АВА 11 2 Время культивирования, суз. нуированную неревертнрующую линию /е!з/глгагг!а с полющью лелеции одного из важных щ1я метаболизма генов (например, гена дигидрофолатредукзазы — тимидилатсинтазы). У одного из таких паразитов, /егуйтата гла/ог Е!0-5ЛЗ, два гена диз идрофолатредуктазы-.тимидилатсинзазы были заменены генами устойчивости к антибиотикам О-418 н гигромицину.
В огличие оз паразитов дикого тина, прн выращивании /.. гла/ог Е!О-5АЗ в обычной культуре или в культуре макрофагов в среду необходимо добавлять тимидин (рис. !!.7). В организме мышей ВАЯВ/с паразиты оставались жизнеспособными в течение нескольких дней, что достаточно лля создания стойкого иммунитета у живогных (рис. 11.8)„но недостаточно лля развития заболевания. Нн персистиру1огцая инфек- — в — Контрольные мыши -- . Вакппнвровапные мыив 5 В 4 Ю. зй ск 1 250 16 ф 14 й!2 10 и 6 4 к 2 о" о -.-ь — Лакай тип -.:. - Апспуарованныа паразит 50 100 150 200 Врал~в после инфекции, сут Рвс.
11.7. 1! ролиферапил В глагол.лнкого типа и аттепуированпого парази га в мышиных макрофагах. Длв инвазии в обоих случаял использовали одинаковое количество /.. глазог, нахоашцихся в стационарной фазе. (Из работы Т!1пь' ег а1.. Ргос. !уаг/. Асаг!.,угз'. РВА 92: !0267-10268, 1995, с изменениями.! цня, нн заболевание не возникали даже у наиболее чувствительных видов мышей, так что данная линия вполне подходит для создания вакцины. Проведя дополнительные эксперименты на животных, можно будет проверить ее эффективность при иммунизации человеки.
«Векторные» вакцины ///зогливовирусные вакцины В качесгве эффективной живой протнвооспснной вакцины широко используют вирус коровьей оспы (ВКО), относящийся к роду поксвирусов. Геном этого вируса полностью секвенирован; он представляет собой двухцепочечную ДНК длиной 187 тш.н., кодируюшую примерно 200 разных белков. ДНК ВКО реплициру- Рвс. 11.8. Иммунитег к вируленпюму паразиту /., то/ог, вырабатываюшийсв у мышей ВА1.В/с после иввазии ат1енуированпого паразита / та/ог. В момсгп времени 0 мышей, предваризсльно вакцинированных аттенуированным паразигом, заражали вирулептиым паразитом, а затем определяли средний размер лейшмапиозпых лзв.
Контрольных мышей пе вакпипировали. (Из работы П1пв е1 а!., Ргос. гуаГ/. Асаг!. Ьсй !ЛзА 92: 10267-10268, 1995, с изменениями.) Вакцины 239 яла ВКО-промознр 1ен тимилинкииизы ВКО ген тимидиькиназы ВКО ила ! си знз иынцо~а белка ДНК ВКО ВКО-ароьниор ДНК ВКО ется в цитоплазме инфицировинных клеток, а не в ядре, благодаря наличию у вируса генов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы и ферментов„осуществляющих кэпировиние, метилирование и полиаденилиронание мРНК. Поэтому„если в геном ВКО встроить чужеродный ген, так чтобы он находился под контролем ВКО-промотора, то он будет экспрессироваться независимо от регуляторных и ферментных систем хозяина. ВКО имеет широкий спектр хозяев (позвоночных и беспозвоночных), ощиется жизнеспособным н течение многих лет после лиофилизации (испарения воды с помощью замораживания) и не обладает онкогенными свойствами, а потому может использонаться для создания так называемых векторных вакцин. С их помощью осуществляется досгавка и экспрессия н организме-хозяине клониронанных генов, кодируюших антигенные белки, которые индуцируют выработку протективных антител.
Геном ВКО имеет большие размеры и не содержит уникальных сайгон рестрикции, что не позволяет встраивать н него дополнительные нуклеотидные последовательности. Однако нужные гены можно вводить н геном ВКО с помощью гомологичной рекомбинации 1п у)уо следующим образом. 1. Сегмент ДНК, кодирующий специфичный антигсн (например, НВсАВ), нстраинают в плазмидный вектор непосредственно после клониронанного ВКО-промотора, включенного н какой-либо несущественный ген ВКО, например ген тимилинкиназы (рис. ! 1.9, А).
2. Этой плазмидой трансформируют культуру дефектных по тимидинкиназе животных клеток, обычно фибробластон куриного эмбриона, предварительно инфицированных ВКО дикого типа, который синтезирует функциональную тимидинкиназу. 3. В резулщите рекомбинации между нуклеотидными последовательностями, фланкирукяцими промотор и ген протектинного антигена, и гомологичными последовательностями вирусного генома происходит встраивание клонированного гена в вирусную ДНК (рис.
11.9, Б). Частота таких рекомбинаций невысоки„однако популяцию клеток, содержащих реком- Рис. 11.9. Встраинаиие в ДНК ВКО зена, белковый продукт которого (обычно вирусный анзиген) индуцируег иммупный отнет. А. Плазмиди, несущая ген аптигенпого белка, способный экспрессироваться. Б. Двойной кроссипговер, приводюцяй к встраиванию этого гена в ДН К В КО. бинан[ный ВКО, можно обогатить, используя селектинную среду с бромдезоксиуридином. Этот токсичный аналог тимидина н отсутствие тимидинкиназы не включается н синтезируемую ДНК и не оказывает токсического действия. Дефектные по тимидинкиназе клетки-хозяева, которые содержат обычный ВКО, в присутствии бромдезоксиуридина погибают, а клетки, несущие рекомбинантный ВКО с разрывом н гене ти- 240 (ДАВА 1! ДНК ВКОднкогетлле Прелый фланг Лееыв лент Ген»р37 ДНК мутентного ВКО Прлеыя ланг Вектор не еснеее ВКО Преемн фланг Левый фллгш Ген-мишень Ген»у37 р7.5 мидинкиназы, становятся устойчивыми к его токсическому действию.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
