Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 71
Текст из файла (страница 71)
Кроме того, это защищает клетку от проникновения в нее любой чужеродной ДН К, например вирусной. Один из подходов к решению проблемы деградации хозяйской ДНК гетерологичными эндонуклеазами рестрикции состоит в клонировании и экспрессии в реципиентном организме как гена фермента рестрикции, так и гена соответствующего модифицирующего Фермента. Однако клонирование обоих этих генов в одном микроорганизме технически затруднено, если они расположены на хромосоме донорного организма далеко друг от друга.
Кроме того, чтобы не допустить расщепления хозяйской ДНК эндонуклеазами рестрикции, метилирующий фермент после трансформации должен синтезироваться еще до начала синтеза рестриктазы. На рис. !2.! представлена стратегия выделения и клонирования в Е. сей гена рестриктазы Рзй грамотрицательной бактерии Ргоиг(сяс(а зюаг1й. !. ДНК Р. згиаггй расщепляют с помощью Илг)!11 и встраивают Фрагменты в Нйк!П1- сайт плазмиды рВ!(322. 2. Рекомбинантными плазмидами трансформируют клетки Е.
гой Е!В !01 и выращивают их в жидкой среде, а затем инфицируют бактериофагом ).. Если в хозяйской клетке экспрессируется ген фермента рестрикции, то она оказывается устойчивой к литическому действию Фатов типа )., ДНК которых активно расщепляется синтезируемой рестриктазой. 3. Трансформированные клетки, устойчивые к фагу )., подвергают осмотическому шоку, чтобы высвободить периплазматические бел- ки.
Определяют активность рестриктазы Рзг! в белковом экстракте. 4. Положительные клоны тестируют на наличие Рзг)-метилирующей активности. Один положительный клоп, выявленный в этом эксперименте, содержал встроенный фрагмент ДНК длиной 4 т. п. н. с интактным опероном рестрикгазы и метилазы Рзг! и промотором Р. згиагШ. В клоне, несущем эту генетическую конструкцию, соблюлался естественный временной порядок синтеза: вначале синтезировался метилирующий фермент, затем эндонуклеаза рестрикции. Уровень экспрессии гена рестриктазы Рзй в Е.
сей был примерно в 10 раз выше, чем в Р. хгиагФ. Как и предполагалось, рестриктаза находилась в периплазматическом пространстве, а метилаза — в цитоплазме. Метол получения РЯ клонированием соответствующего гена в Е. сей гораздо более эффективен, чем выделение этого фермента из Р. зшагйй Для выделения генов, кодирующих Ферменты рестрикции и модификации (метилирования), можно использовать также другой подход, который состоит в следующем. !. Создают банк клонов ДНК организма-данора„продуцирующего известную эндонуклеазу рестрикции. Используемый при этом плазмидный вектор должен содержать по крайней мере один сайт узнавапия для этой рестриктазы.
2. Трансформируют Е. сой гибридными плазмидами. 3. Из трансформированных клеток, выросших в жидкой селективной среде (т. е. из клеток, содержавгих плазмиду), выделяют плазмидную ДНК. 4. Обрабатывают ее интересующей исследователя эндонуклеазой рестрикции. 5. Трансформируют Е. сей плазмидными ДНК, обработанными эидонуклеазой рестрикции. Ключевым моментом этого метода является то, что плазмидная ДНК клонов, несущих и экспрессирующих ген фермента модификации, оказывается устойчивой к расщеплению соответствующей эндонуклеазой рестрикции, поскольку сайты узнавании в ней метилированы.
Использование рекомбинаитных микроорганизмов для получения коммерческих продуктов 249 11К Р. ггвлгя1 РВН322 Рпл41П гвгвза фага Т4 Клоннроввнввя ДИК Трансформация Е сод Рост вжидкой среде Ивфкмировкнне фаюм 1г Отбор колоний, устои вялых к фвгу Ряс. 12Л. Клонирование гена рестрикталы Рг11 и отбор несущих его трансформированных бактериальных клеток. Хромосомную ДНК Р. ггггоггй расщепляют Н!пйИ\ и встрвивакп фрагменты в плазмиду рйгт322.
Трансформируют рекомбинантиой плазмияой Е. со11, вырвщивакгг клетки в жидкой среде и инфицируют фатом К Отбиракп трансформанты, устойчивые к фату; именно они несут н зкспрессируют клонированный ген Р411. Рассмотрим следующий пример. В плазмиду рВК322 встраивали Н11111Н1-фрагменты ДНК Оехгг11от1Ьпо дезифиг1сагм и трансформировали ею клетки Е са1б Выделенную из трансформированных клеток плазмидную ДНК обрабатывали рестриктазой Рде1.
Плазмиды, несущие и зкспрессирующие ген метилирующего фермента, не расщеплялись, поскольку все восемь сайтав узнавания ЕЫе1 в рВЙ322 были метили- рованы. Смесь плазмид, обработанных Же1, использовали для трансформации Е. со11. Образование трансформантов, несуптих ген функци- онального модифицирующего фермента Вг1е1, обеспечивали только целые кольцевые молекулы плазмидных ДНК.
Остальные плазмиды были расщеплены зндануклеазой рестрикции. Для тата чтобы определить, какие клоны содержат и ген фермента модификации, и ген зндонуклеазы рестрикции, трансформанты тестировали на наличие в них активной рестриктазы ХЮе!. Описанный подход можно с успехом использовать для выделения гена любой рестриктазы, липп, бы он находился достаточно близко к гену соответствующего модифицирующего фермента и 250 ГЛАВА 12 был встроен н плазмидный вектор, имеющий по меньшей мере один сайт узнавания для данного ферме»па.
Малые биологические молекулы Используя технологию рекомбинантных ДНК, можно направленно изменять метаболизм микроорганизмов, вводя в них новые гены или модифицируя уже существующие. Основной целью таких изменений является создание рекомбинантного микроорганизма с новой ферментативной активностью, способного превращать существующий субстрат в ценный продукт, который обычно получают только сочетанием химических и микробиологических методов. Синтез Е-аскорбиновой кислоты В настоящее время для крупномасппабного производства (=аскорбиновой кислоты (витамина С) используют весьма трудоемкий процесс, включающий одну микробиологическую стадию и несколько химических; исходным субстратом для него является О-глюкоза (рис. 12.2). На последнем этапе этого процесса 2-кето-(.-гулоновая кислота (2-К) О) превращается в кислых условиях в 1.-аскорбиновую кислоту.
Биохимические исследования метаболизма различных микроорганизмов показали, что 2-К(.О можно получить другим путем. Так, одни бактерии (АсегоЬастег, 6(игогюЬасгег и Ег»г»п»а) могут превращать глюкозу н 2,5-дикето-()-глюконовую кислоту (2,5- ОК(»), а другие (СогупеЬасгег»ит, ВгеиЬасгег(ит и Аггйгабасгег), синтезирующие фермент 2,5- ОКО-редуктазу, — преобразовывать 2,5-Е)КО в 2- КИ». Использующийся в настоящее время способ получения аскорбиновой кислоты можно усовер»иенствовать, если включить в него совместное культивирование указанных микроорганизмов для превращения глюкозы в 2-К(.О».
К сожалению, такое культивирование имеет свои трудности. Например, используемые микроорганизмы могут иметь разные оптимумы температур»я и рН, могут различаться также состав среды и скорость роста. Иными словами, условия культивирования, оптимальные для одного организма, могут быть неприемлемы для друго- го, что приведет к спонтанному «вымыванию» из среды одного из них.
В подобных случаях можно культивировать микроорганизмы последовательно (рис. 12.3), правда такой процесс трудно будет сделат» непрерывным, если для роста микроорганизмов необходимы существенно разные среды. Наилучшим ныходом из этой ситуации было бы создание одного микроорганизма, синтезирующего все ферменты, необходимые для превращения глюкозы в 2-К(.О. Еги Ьиа ЬегЬ»со1а осуществляет превращение 0-глюкозы в 2,5-ОКО в несколько стадий, катализируемых разными ферментами, в то время как Согупебасгег»ит зр.
для превращения 2,5-ОКО в 2-К).О необходима только одна стадия. Следовательно, наиболее простой способ создания одного микроорганизма, способного пренращать Г»-глюкозу в 2-К( О», состоит в выделении гена 2,5-ОКО-редуктазгя СогупеЬасгеиит зр. и введении его в Ег»г»п»а ЬегЬ»со(а. Перный шаг на этом пути состоит в выделении и очисзке 2,5-РКО-редуктазы СогупеЬастиит ар. и определении последовательности ее первых 40 11-концевых аминокислот.
Исходя из этих данных были синтезированы два 43-нуклеотидных гибридизационных зонда, соответствовавших разным частям белковой молекулы. Поскольку 71% нуклеотидов ДНК СогупеЬасгепит нр. представляют собой либо О, либо С, зонды синтезировали таким образом, чтобы в третьем положении кодонов по возможности находились именно они. Зто позволяло минимизировать число неспаренных оснований между зондами и искомой ДН К.
Синтезированнгае зонды использовали для скрининга банка клонов ДНК СагупеЬасгепит; клоны, гибрилизующиеся только с одним из зондов, исключали из дальнейшего рассмотрения, считая, что соответствуюпшя ДНК не является искомой. Выделяли клон, содержащий ген 2,5-ОКС»-редуктазы, и секненировали его.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
