Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 73
Текст из файла (страница 73)
!2.7. Схематичное изображение бяореактора, в котором можно было бы осуществлять синтез индиго с использованием рекомбинантных клеток Вк со(Ь Клетки иммобялнзованы на частицах твердого матрикса. В ре- актор непрерывно подастся субстрат (триптофан) и непрерывно выводится продукт (нндиго). Скорость перено- са вещества через реактор яимятируется скоростьн> превращения субстрата в продукт.
продукта. Эта система егце не готова для коммерческого использования, но уже ясно, что микробиологический процесс мог бы проходить в биореакторе, в котором рекомбинантные Е соВ химически иммобилизованы на твердой матрице (например, на целлюлозе или силикагеле). Реактор мог бы работать в непрерывном режиме, с поступлением триптофана с одной е1о стороны и удалением индиго с другой (рис. 12.7).
Синтез аминокислот Аминокислоты широко применяются в пищевой промышленности — в качестве усилителей вкуса и аромата, антиоксидантов и пищевых добавок; в сельском хозяйстве — в качестве кормовых добавок; в медицине — для терапии послеоперационных больных; в химической промышленности —.
в качестве исходных веществ при синтезе полимеров и производстве косметических средств (табл. 12. !). По оценкам, ежегодно в мире производится более 800 000 т аминокислот стоимостью более 5 млрд. долларов. При этом больше половины общего объема производства приходится на долю !.-глутаминовой кислоты, которая используется для получения широко известного усилителя вкуса и аромата — глутамата натрия. В промышленном масштабе аминокислоты получают в основном либо экстракцией из белковых гидролизатов, либо как продукты гяетаболизма двух неспорулирующих грамположьпельных почвенных бактерий, СогулеЬаггепит или Вгет!Ьасгег(игл зрр. Обычно для повышения продуктивности этих микроорганизмов использует- ся мутагенез с последующим отбором штаммов— сверхпродуцентов определенных аминокислот.
Однако такой способ получения штаммов требует много времени, а эффективность его невелика. Альтернативный подход мог бы состоять в выделении и изменении специфических генов, кодирующих ключевые ферменты определенных биохимических реакций, на основании детальных биохимических данных об этих ферментах. Впрочем, такой генноинженерный подход может оказаться не столь простым. Так, в биосинтезе некоторых аминокислот могут участвовать несколько ферментов, которые активируются или ингибируются различными метаболитами, присутствующими в клетке. В такой ситуации трудно определить, какой фермент нужно модифицировать, чтобы увеличить выход конечного продукта.
Кроме того, ученые пока не располагакп исчерпывающими данными о биохимических свойствах указанных выше микроорганизмов, а соответствующие генноинженерные подходы находятся на стадии разработки. В 'шстности, только создаются экспресс ирующие векторы и методики трансформации для грамположительных организмов типа СогулеЬастеггит и ВгеггЬасте пита арр. Большинство плазмидных векторов с широкилг кругом хозяев реплицируются только в грамотрицательных микроорганизмах, поэтому необходимо создать векторы, специально предназначенные для экспрессии в СогулеЬасгепит и ВгеиЬасгег(игл зрр. Это могли бы быть челночные векторы Ьф со — СогунеЬаг гелия.
Та их часть, которая происходит из плазмид Е. соВ, может со- 256 П1АВА 12 Применение/Свойства Амииокисл оса Усилитель вкуса и аромега Лечение загюлевапий печени Алании Аргицин Аспарагин Аспарагнновая кислота диуретик Усилитель вкуса и аромата; си и сз 1юлсласти'гелей Растворы ляя внугривспных инъекций Валин Гистилин Глицин Лечение язв; агпиокшшант Синтез полсластизелей Ле генис язв Глугами и Глугам и нова я кислота Игюлсйпин Усилитель вкуса и аромаи Распкчзы лля внутривенг гых инъекций Лсйцип Расгворы лля впугривепньи инъекций Лизин Кормовая лобавка; пищевая добавка Кормовая добавка Расцюры лля внугривепных инъекций Метиопин Пролиг г Перин 1ИРОЗИН трсонигг трнцтофан Кормовзя лобавка Растворы лля внугривснных инъекпий; анз иоксьщант Фснилаланин цисиин Мупппный шимм Мупштпый шими, солержаший вектор д й дикий тнп, содсрх ащий вектор 0,34 0,48 Таблица /2.1.
Применение аминокислот Косметическая промышленпосз ь Расг ворь1 лля внутривенных инъекций: прелшествеяник !.-ПОРА Инфузинг сигггез полсласгитслей Произволсгво хлсба; лечение бронхи га; аго иоксгщапт держать гены устойчивости к тетрациклину, хцорамфениколу или канамицину. Поскольку и Е. со//, и СогупеЬас/еаигп зрр. чувствительны к данным антибиотикам, эти сены могли бы служить селективными маркерами для обоих микроорганизмов. Зффективный метод трансформации С.
д1ы/опг/сггпг, олного из видов СогупеЬосгеиит, часто используемых в такого рода экспериментах, до сих пор не ралзаботан. Мнопге гены С я/ц/огп/сгггп неэффективно зкспрессируются в Е. со/с Поэтому для систем отбора, основанных на экспрессии гена (например, при комплементации), клетки С'. Л/и/отнят должны быть трансформированы полным банком клонов. К сожалениго, частота трансформации при введении ДНК в С.
л/итоги/сиги обычным способом иди электро- порацией очень низка. Ее можно существенно повысить, если для введения чужеродной ДНК использовать конъюгацию или удалить клеточные стенки трансформируемых клеток лизоцимом (использовать протопласты).
Проникновение экзогенной плазмидной ДНК в протопласты облегчается в присутствии полиэтиленгликоля. Получены первые положительные результаты в увеличении выхода незаменимой аминокислоты триптофана, синтезируемой С К/и/описит. Дзи этого в клетки С. К/и/огп/сиги дикого типа была введена вторая копия гена„кодирующего антранилатсинтазу, фермент, лимитирующий синтез триптофана (рис. 12.8). Ниже описан один из способов выделения этого гена.
!. Библиотеку хромосомной ДНК //геу/Ьос/егьцт//отигп клонировали в челночном некторе С. я/11/огп/сиги — Е. со//и ввели в мугагггный штамм С, тг/и/ат/сиги, не синтезирующий активной антранилатсинтазы. 2. Трансформантов отобрали по их способности расти в отсутствие антраниловой кислоты. Этим они отличались от мутантных не- трансформированных клеток. 3. Вектор, содержащий ген антранилатсинтазы, перенесли в штамм С. К/и/огп/сиги дикого типа.
В табл. 12.2 представлены результаты определения количества триптофана, синтезированного мутантным штаммом С. к/игагп/сонг и штаммом дикого типа, которые содержали или не содержали вектор с клонированным геном антранилатсинтазы. Как видно из таблицы, клони- /аллина /2 2. Синтез трнптофана нскоторымн штаммамн С х/ы1атгсыгл при стандартных условиях роста" Коинетрания триптофаиа, мг/мл '1 По лилии Ои81 ег х1.. Ц.з аа1ео1 4„874.698, !989.
Использоаапне рекомбинантных микроорганизмов ллл гюлучеиил коммерческих продуктов 257 Фосфоегиипируааг ЗГлггргхго- Ьфосфаг МБ а- — — — — — — — — — — —— 3-лезхкси-ГЗ-араби1гогсигулозсиаь-7-ф(кфаг 1 Шикииаг Феиилахапии 1 Хоризиаг Рйр 1- 1 ли,мпии Аиграггахаг рованный ген практически полностью восстанавливал способность мутантного штамма синтезировать трнптофан. Однако эффект введения этого гена в штамм дикого типа был сиге сильнее: уровень синтеза трнптофана в этом случае увеличивался примерно до 130%, что связано с более эффективным использованием доступных предшественников.
Еще более высокий уровень синтеза триптофана достигался при введении в клетки С. д)пГатктглг модифицированных генов трех ключевых ферментов: 3-дезокси-В-арабиногептулозонат-7-фосфатсннтазы, антранилатсинтазы и аитранилатфюсфюрибозилтрансферазы. Гены, кодирующие эти ферменты, благодаря внесенным в них мутациям стали нечувствительны к ингнбированию конечным продуктом (ингибирование по типу обратной связи).
Ы качестве альтернативы для синтеза аминокислот можно использовать Е. сой. Этот микро- ы -Бив Рис. !2.8. Упрощеннал схема биосинтеза триптофана в клетках С Х)лГалпсат. Сплошные линии— биосинтетические реакции„штриховые — ингибирование по типу обратной связи. В качестве побочного продукта образуется индол, который превращается в триптофаи под действием триптофансинзазы р. 17й — 3-дезокси-13-арабипогептулозонат-7-фосфатсинтаза. Л1ЧЫ вЂ” антранилатсиитаза, РКТ— аитранилатфосфорибозилтрансфораза.
организм хорошо изучен, а гегпюииженернгле методы работы с ним более нли менее детально разработаны. Со времени открытия пенициллина в конце 1920-х годов из различных микроорганизмов были вьщслены более 6000 антибиотиков, обладающих разной снецифичпосп,ю и разным механизмом действия. Их широкое применение для лечения инфекционных заболеваний помогло сохранить миллионы жизней.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
