Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 77
Текст из файла (страница 77)
Мгггсбюб 56: 9г9-9?3, ! 990. З! Ка ~гг гсства абгозуюгвегсся ирзлук в вырвжсва в висле микрогрвммав нв ! мл кулыуры, рвстувгей ив мнвимазвной среде в иригутствии 0.4% глюкозы нли 0,4% лвкгазы либо вв рвзбзвлсннай П0%! сыворотке. «алержа~ггсй примерно 0,4% ляктсаги трзгкбюрмзнт содержит а твз милу, несутгою гены Гасгт Е. юх. 268 !ЛАВА 12 ОЗВНаЗ5Я ЯВ$2 ВЗ1 тиаюз51на5ы ПВВ! Мсланины -- это нерегулярные полимеры, состоящие из остатков индола, бензотиазола и аминокислот. Первый этап их биосинтсза катализируется мсдьсодержашим ферментом монооксигеназой тирозиназы и представляет собой окисление тирозина до дигидроксифенилаланинхинона.
Последние этапы полимеризации нс являются каталитичсскими реакциями и в зависимости от химической природы нехинонных сослинений, включающихся в полимерную структуру, дают коночные продукты разных цветовв: чсрнОГО, коричг!сВОГО, жслтОГО, краснОГО или фиолетового. Выделены и охарактеризованы гены биосинтсза меланина в бактериальных клетках 8ггер!Отусев ивВЬ(ойгиж Они содержат две открытые рамки считывания (ОКР), одна из которых кодирует тирозиназу (мол. масса 30 600), а вторая (ОКР438) -- белок (мол.
масса примерно !4 800) с неизвестными функциями. Г!тобь5 проверить, нужны ли оба этих гена для синтеза меланина, гены сначала псреклонировали в экспрсссирукнций' вектор Е. Со(0 при этом одна конструкция содержала только ген тирозиназы, а другая — и ген тирознназы, н ОКР438 (рис. 12.19). Вектор, несущий ген тирозиназы, обеспечивал синтез ббльших количеств тирозиназы, чем вектор, содержащий оба указанных гена. Однако оказалось, что уровень тирозиназы не имеет особого значения, а для биосинтсза мсланина необходимы продукты обоих генов. Возможно, белок, кодируемый ОКГ438„поставляет ионы меди неактивному предшественнику тирозиназы апотирозиназс, которая активируется в их присутствии. В естественных условиях после образования дигилроксифенилаланинхинона при участии тирозиназы в полимер включаю5ся раз- личнл5с низкомолекулярные соединения (нехино55ы).
С учетом этого можно изменять химические и физические свойства мслани на, сиптсзируемого в клетках Е. сой с введенными В них ключевыми генами биосинтеза этого полимера, если добавлять в среду определенные низкомолекулярные соединения в разных количествах. Микробиологический синтез хсивотногг5 баополамера с' адгезивными свойствами Весьма перспективной представляется также разработка недорогого способа получения белка с адгезивными свойствами, впервые выделенного из мидий Муг57из ег(ийж Этот водостойкий белок образует очень прочные нити, с помощью которых моллюски прикрепляются к разнообразным поверхностям.
Сразу после секреции биополимера так называемой' биссаловой железой между полимерными цепями образуются многочисленные поперечные сшивки, что затрудняет определение их аминокислотной последовательности. Это в свою очередь пс позволяет установить нуклсотидную последоватслыюсть кодирующих их генов и синтезировать гибридизационные зонды.
К счастью, удалось выделить в55утриклеточный предшественник адгсзивного белка (130 кДа-предшественник). Как показали биохимические исследования, оп бопп серином, треонином, лизином, пролином и тирозином. От 60 до 709В этих амипок5ислот содержат гидроксидьную группу, при этом большинство остатков пролина и тнрозина гидроксилированы до 3- или 4-гидроксипролина (Нур) и 3,4-дигидроксифенилаланина (ВОРА) соответствешю. Кроме того„ после определения аминокислотной гюследоватсльности выяснилось, что предшественник состОит В ОснОВнОм из повторяюпгихс5! Дскапспт и- Рвс.
12.19. Экспрссснрующис плазмилы К со!1, несущие гены биссинтсза мсзанина. рВСС619 содержит ген тирозиназы, а рВОС6203 .. Открьпую рамку считывания (ОКР438) для синтеза меланипа в Гсв тирозиназы. Транскрипция клонированных генов осуигсствляется под контролем промотора Р ., бахтсриофага Т7.
КВБ! и КВБ2— два разных сайта связь5ван5и рибосом. Обе плазмиаы несут гены устойчивссгв к ампициллину (Ащр'). Использование рекомбипантных микроорганизмов лля получения коммерческих продуктов 2б9 5' ССА АСС ТАС ААА ССТ ААС ССС ТСТ ТАТ ССС 3' 3' ТТТ ССА ТТС ССС АСА АТА ССС ССТ ТСС АТС 5' Рго-Тог-Туг — Гуз-А(а-1уз-Рго-5ег — Туг- Рго-Рго-Тог-Туг Рис. !2.20. Синтетический олигонуклеотид„послуживший основой лзя создания гена алгсзивиого белка, синтезяруемого мидией М. егГиГсс Второй синтетический олигонуклеотид был синтезирован таким образом, чтобы после отжита с первым образовывался фрагмент двухпепочечной ДИК с липкими концами.
! Гослелующее лишроваиие с помощью ДН К-лищзы фага Т4 привело к образованию линейной ДН К, состоящей из представленныхх на рисунке повторов. Внизу лана амннокисло шая послеаовюсльность полипсптида, коаируемого этим повтором. ОН О ОН ОН Кюехолоке иле та О Ряе. 12.21. ! !остгрансляциопиое гилгюксилировапие )и т)гго некоторых тирозииовых остатков алгезивного белка М. ег(шуж При участии тирозиназы тирозии превращается в ВОРА, после чего он может быть окислен до о-хинона ка. тсхолоксидазой или тирозиназой.
Окисление можно предотвратить добавлением аскорбиновой кислоты. Тирозииаза УзОз ЦО / Аскорбиновая кислота СН, О н ! !! — !Ч вЂ” СН вЂ” С— Тирознн СН О Н ! !! — М --СН вЂ” С- СН О Н ! !! — Н вЂ” СН вЂ” С— о- Хинон дов А)а-1.уз-(Рго или Нур)-бег-(Туг или ООРА)- Нур-Нур-Т)зг-ПОРА. 1.уз. Из библиотеки кДНК, которая была получена на основе мРНК, выделенной из биссюювой железы, была изолирована кДНК ! 30 кДа-предшественника адгсзивного белка. И адгсзивный белок, и его кДНК обладают весьма необычными свойствами, затрудняющими клонирование и экспрессию соответству~опГих генов и получение функционального алгезивного белка.
Вопервых, кДНК содержит большое число повторов, что повышает частоту гомологичной рекомбинации и вероятность утраты части клонированной послеловатсльности. Во-вторых, поскольку примерно 70% всех аминокислот белка приходится на долю пролина, лизина и тирозина, вряд ли его удастся получить в большом количестве вследствие ограничешюсти внутри- клеточного пула аминоацил-тРН К. Чтобы преодолеть все эти трудности, полно размерную кДНК адгезивного белка или ее фрагменты встроили в дрожжевые экспрсссирующие векторы и ввели эти векторы в дрожжевые клетки. После экспрессии были получены новые активные формы адгсзивного белка мол.
массой от 20 до Н)0 кДа, причем на их долю приходилось от 2 до 5% суммарного количества клеточных белков. Значительно более высокого уровня экспрессии удалось Лостичь после того. как был химически синтезирован геп адгезивного белка (рис. 12.20). Используя повторы ДНК, кодирующис дскапептид ацгсзивного белка, создали синтетический ген длиной 600 п. и., который кодировал белок мол. массой примерно 25 кДа. Его основная повторяющаяся сдиннцадлиной 30 и.
н. состояла из кодонов, оптимальных для экспрессии в Е. сей, а эффективная экспрессия происхолила, когда он находился пол контролем промотора фага Т7. Большинство микроорганизмов обладают лишь ограниченной способностью осуществлять посттрансляционное гидроксилирование аминокислот, так что образующийся белок бывает не до конца гидроксилирован. Так„пекоторыс из его тирозиновых остатков не превращаются в ПОРА, что снижает число образующихся поперечных сшивок. Чтобы решить эту проблему, была создана система гидроксилирования ш И!го, в которой бактериальная тирозиназа в присутствии аскорбиновой кислоты гидроксилировала остатки тирозина (рис.
! 2.2 ! ). Аскорбиновую кислоту добавляли в реакционную смесь для того, чтобы предотвра- 270 ГЛАВА 12 тить окислсние остатков ПОРА в о-хиноп. Этот процесс должсн строго контролироваться„поскольку он приводит к сшиванию субъсдиниц адгсзивного бслка. Как и многие другие клен или адгсзивы, адгсзивный белок необходимо активировать непосредственно пород использованном. При окислении прсдшсственника адгсзивного белка и образовании сшивок бслок может связываться с разнообразными повсрхностялзи— из стскла, полистирола, коллагена и т. д. Прочность и специфичность связывания можно измснять добавлснисм к слзсси адгсзивпых белков до окисления и образования сшивок других белков. Это позволясг создавать клси с уникальными сяойствами, в том число и такис, которыс можно будст испюльзовазь в мсдицинс, в частности в стоматологии.
Микробиологический' синтез каучука Натуральный каучук, Лиг-1,4-полиизопрсн,— это широко используемый биополимср„который получают из различных растсний, Его биосинтез начипастся с превращения простых сахаров и включает 17 фсрмснтативных реакций.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
