Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 78
Текст из файла (страница 78)
В ходе последней из них происходит полимеризация изопснтспилпирофосфата с образованием аллилпирофосфата. Ввиду большой коммсрчсской цснности каучука были провсдсцы исследования, направлснцыс на то, чтобы выяснить, можно ли использовать для его получения рскомбинаптныс микроорганизмы. Прсждс всего с помощью мРНК из растения 7Гегеа Ьгав)!Гепз)г, синтезирующего каучук, была создана соотвстствующая кДНК-библиотска. Затсм провсдсна гибридизация с коротким ДНК-зондом, синтезированным исходя из даннгдх об аминокислотной послсдоватсльпости одного из учасзков молекулы полимсразы каучука.
Для того чтобы доказать, что клонированная кДНК дсйствитсльно кодирует этот фсрмспт, использовали антитела к очищенному фсрмспту. Теперь, используя этот клон кДНК, а также, возможно, другис гоны биосиптсза каучука, можно попытаться синтезировать натуральный каучук микробиологическими методами. С другой стороны, с помощью этой кДНК можно такжс получить полимсразу каучука и создать каталитичсскую систему ш гпго. В любом слу- чае исследования, которые могли бы привести к разработке нового пути биоси~тсза каучука, имсст смысл продолжить. Микробиологический синтез полигиороксиалканоатов Пол игидроксиалканоаты — зто биодсградируемыс поли меры, синзсзирусмыс множеством микроорганизмов (прсждс всего А)са)фепез еитгорйиг) и использующиеся ими как внугриклеточный источник углсрода и энергии.
Они обладают разными свойствами в зависимости от состава и могут примсняться лля получения биодегралирусмых пластмасс, использусмых, например, для изготовлспия упаковочного матсриала. По оценкам, годовой объсм продаж биодслрадирусмых пластмасс составляст примерно 1,3 млрд. долларов. Из вссх полигидроксиалканоатов наиболее полно изучсна и охарактсризована поли(3-гидроксимасляпая кислота). Это относится как к самому полимеру, так и к кодирующилз его синтез генам 4.
еиггорйик Поли(3-гилроксимасляную кислоту), сс сополимср поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалсрат) и другой полиоксиалканоат, поли(3-гидроксивалсриановую кислоту), получают в Великобритании в промышлснном масштабе фсрмсптацисй при участии 4. еи!горбик Однако этот микроорганизм растст относительно мсллспно и используст лишь ограниченное число источников углерода, что дсласт производство довольно дорогим. Можно использовать другой путь: при перенесении гонов биосинтсза этого полимсра в Е со)1 получаются быстрорастущие трансформанты, накапливающие в бельшом количестве (до 95% сухой массы клсткя) поли(3-гидроксимасляную кислоту). Поли(3-гидроксимасляная кислота) синтезирустся из ацстил- СоА в три счалии, катализирусмыс тремя разными фсрмспзвми (рис.
12.22). Опсроп, содержащий зти гены, был встроен в плазмиду в составс фрагмснта длиной 5,2 т.п.н., однако в отсутствис сслсктивного лавлсния, цапримср при росте в отсутствие антибиотиков, примерно половина клеток г.. год тсряла данную плазмиду ужо после 50 генераций. Ъ~о нс очснь сушсствснно, когда масштабы культивирования малы, по становит- Использование рскомбинаитиых микроорганизмов для получения коммерческих продуктов 271 Ацетих-СоА 3-кетотиохаза Ацетохпетих-СоА Ацетоацетил-СоА— Редукте за 13-3-гидрокеибутирих-СоА Поли(3-гизрокеи- масляная кислота)— синтеза Поки(3-гидрокеиыаеляиая кислота) '- Ацетш~хСоА 3-акиготиоввхв ь~ети СоА Адгетеацетвк-СоАФелуктеза '3-гидрпксгхбутийив-соА валерия-СоА Поли(3-пырокеи- .. ияяляиах кисипа)— :еиитвза ' Рис.
12.23. Микробиологи- ческий синтез поли(3-гидрок- еибугирата-со-3-гидроксива- лерата). по)1и(3-гидрокоиивезгяикихисхоте) поли(3-:гидвокеибужратео;3-птлвокеивктерит) Рис. 12.22. Синтез поли(3-гилроксимасляиой кисло- ты) из ацетил-СоА, Справа от стрелок указаны фер- менты, квтвлизируюшие соответствуюшие реакции. ся серьезной проблемой при крупномасштабной илн непрерывной фермснтации (см. гл. 16). Чтобы обойти эту трудность, в плазмилу, несущую оперон поли(3-гидроксимасляной кислоты), встроили покус рагВ нз другой плазмиды, который обеспечивал стабилизацию плазмид, обусловливая гибель клеток, нс содержащих плазмиды после сегрегации.
Модифицированные плазмиды оставались стабильными даже при конститутивном синтезе поли(3-гидроксимасляной кислоты). Трапсформанты Е. со(й синтезирующие данный продукт, образовывали лишь очень небольшое количество ацетата, гибельного для клеток, по-видимому, вследствие того, что весь избыточный ацстип-СоА превращался в поли(3-гидроксимасляпую кислоту), а не в ацетат. Рще одно преимущество синтеза поли(3-гидроксимасляной кислоты) в Е соВ состоит в том, что когда се экстрагируют щелочным раствором хлорноватистокислого натрия (калия), то опа разлагаезся в меныпсй степени, чем при экстракции из И.
еиггорЛик По-видимому, это связано с тем, что большая часть полимера, синтсзирусмого в Е. со11, находится в кристаллическом виде, в то время как в А. еиггорйш— в аморфном. При этом полимеры, получаемые этими двумя способами, идс3пичпы. Поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерат) аналогичен по слюны свойствам широко использующемуся полипропилену, так что получение его микробиологическими методами может представлять коммерческий интерес. Олнако штаммы Е. соВ, в которых экспрсссируются гены биосинтсза полимера, синтезируют только поли(3-гидроксимасляную кислоту), а не сополимср. Эту проблему можно решить, используя для экспрессии клетки Е.
со!г, несущие мутации в покусах)пг1К и пГоС. ~агИ ответствен за негативную регуляцию биосннтсза жирных кислот, а ауоС вЂ” за позитивную рог)щяшпо их поглощения. Роль покуса ~агИ в индукции биосинтеза сополимера неясна„но продукт гена агоС влияет на синтез белков, копируемых генами ауоА и ауо0 и облегчающих поглощение бактериями пропионата из кулшуральпой среды.
Послелний превращается в пропионил-СоА и затем реагирует с ацетил-СоА с образованием 3- 272 !'ЛАПА 12 кстовалсрил-СоА, который в свою очередь может превра~наться в З-гидроксивалсрил-СоА, включасмый в сополимер (рис. 12.23). ЗАКЛЮЧ ЕИИЕ Бактерии можно нс только использовать как зфабрики» для синтсза бслков типа рсстриктаз, но и получать с их помощью новые продукты, изменяя мстаболизм бактериальных клеток введснием в них чужеродных генов или модификацией ужо существующих. Можно создавать рскомбинантныс микроорганизмы, сгюсобныс синтезировать самые разныс низкомолскулярныс соелинения: 1.-аскорбиновую кислоту, краситсль индиго, аминокислоты, антибиотики, люномерныс сдиницы различных биополимеров. Общая стратегия при этом состоит во введении в ор1внизм хозяина специфичсских гонов, клонированных в подходящсм вскторе, которые кодируют один или несколько фсрмснтов, катализирующих нс свойственные микроорганизму метаболические рсакции или влияющих на осуществляемый им в нормо биосинтсз опрсдслснных соединений.
По имеющимся данным, создание новых мстаболичсских путсй не является технически неосуществимым. Этот подход поможст создать нсобычныс, болсе зффективныс нуги синтеза самых разных соединений. ЛИТЕРАТУРА Апдегятп В., С. Б. Маг!сз, й. Батагов, Л. Мй!ег, К. Бта)уогт), Л. Бсутпопг, О. 1ЛПЫ, тн'. Ваз1егсег, О. Евсей. !985. Ргодцсйои ор 2-8сто-1.- 8н1опа1с, аи нйепиейа1е ш 1--азсойатс зуитЬеяз Ьу а 8спсйсайу тпосййсд Епн!и!а )югбссо1а.
Япепст 230т 144 — 149, Байсу 1. Е. 1991. Тотнато а зс)епсе оГ щстаЬойс си81псспп8. Яс!епсе 252т 1668 — 1675. Вепгу А. 1996. 1шргон|и8 ргойцспоп о1' агощайс соитроиис)з тп Езсйег1сп1а сай Ьу тпетаЬойс еп8тпссйпй. 7пгпВз Вю!ес1та1. 14т 250 — 256. Вгоо)сз Л. Е., Р. О. )л)а1Ьап, О. ! апдгу, 1 А. Ьгпутег, Р. йта11е-йезз, С. !.. 1нез, 1,. В. Могап, В. Е. 8!айса, Л. Е. Веппсг. 1991. СЬатастепхапоп оОЬе с!овес) ВатН1 гезтпсбоп пюййсайои зуз- 1епт: йз пнс1со1Ые зсс1цспсс, ргорсгйез оГ 1Ьс птетЬу!азс, аис) схртезяоп 1п Ьс1сго1о8оцз Ьозтз.
!!ис1а!с Астс!з Вез.!9т 841- -850. СоЬеп С., О. БЬ)тттвап, М. МенагссЬ, т'. АЬагопотп1х. 1990. МкгоЬта! гзорсщстйш 1Ч зуп1Ьазе 8спея зтгистцте, 1нпс11оп, йнсгзйу апс1 ено1цт)оп. 7) епс!з В!о!ес7тпа1. 8т 105 — 111. йейа-С!арра С., В. Л. Сагйег, С. С. Внег1отн, Т. Н. Тпгреп, 1.. К. Спй. 1990. Мс1аптп ргос)цспоп 1и Елс7тег!сп!а сой 1тотп а с!опсс) 1угозшазе йенс. Вю/Тесйпо1а8у 8т 634-638. Епз!су В.
О., В. Л. Ва1хЫп, Т. О. Озз!ппд, М. Л. Ятяоп, ! . Р. Фас!се!1, О. Т. СтЬзоп. 1983. Ехргсзз)оп оГ парЫЬа1епс охЫайоп 8епез тп Езс7тег1сй!а сай тези!тз ш сйс ЬйозуптЬсз)з оу 1пййо. Яссепсе 222т 167 — ! 69. Вогез !л)., Л. Хлао, А. Веггу, Р. Войнаг, Р. майе. 1996. РатЬтнау спйтпссг1тт8 1ог Ьйе ргодосйоп оГ атсииайс сощроцпс)з 1и Езс1тег!с7т!а сой. !нат. В!атесЛпо!. 14т 620-623. Нозз Н.
С. 1987. НуЬлс) апйЬ)ойсз — бйе соптпЬнйоп оГ 1Ьс пстн 8спс сошЬйпа11опз. 7гегЫз В1атес1тпо1. 5: ! 11 — 1! 5. Рп Л.-Е., т'.-Н. Тзспй. 1990. Сопзтгцсйоп о1!ас1озе-отй)х)п8 Хан!Аотапаз сатрез!г!з апс) ргодцс1юп оГ хапййап 8шп Бтотп ннЬсу. Арр1. Епнп-оп. И1!сгаб!а1. 56т 919 — 923. НаЬп В. К., т'.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
