Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 82
Текст из файла (страница 82)
бактерию?ьные штаммы, способные разрушать бифенил, содержат бифенилдиоксигспазу. В состав этого фермсп?пюго комплекса входят состоя)дая из двух субъединип терминальная диоксигеназа, ферредоксин и ферредоксинредуктаза. По своим структуре и функции бифенилдиоксигсназа сходна с толуолдиоксигеназой, олнако угилизируюшис бифенил псевломонады не могут расти на толуолс, а штаммы, утилизируюшие толуол. пс растут на бифенилс. После того как в штамме КГ7(5 Р. риййа ген Ь)???А)„колирукпций большую субъединнцу бифенилдиоксигсназы, был 236 ГЛАВА 13 гас-Прпмпзор сн, Оз + Окис- Восстанпяленный ленный Впсстаноа- Окисленный (ЧАГ)Н + Н+ Толупл Флавопротсин ( Го6Л) Феррелоксии (то6В) Герминальная диоксигеназа (То6С1С2) цис-Толупл- дипщролипл ОН Н Рис.
13.8. А. Клонированный опсрон толуолдиоксигЕназы, Находящийся под контролем гас-промотора Е. сей. Образование толуолдноксигеназы обеспечивают четыре гена (уог)А, гог(В, ггл(с) и грг)с2~. Ген гоиА кодирует флавопротсин, который акцептирует электроны с восстановленного ннкотинал!идаденинлипуклеотнда (ХАПН) н переносит их на ферредоксин.
Последний кодируется геном грг)В и восстанавливает терминальную дноксигсназу, коднрусмую генами гоаб) и гоп!62 Зги гены эквивалентны генам ху/ХУл на рис. 13.6, Б. Превращение толуола в цис-толуолдигидролиол в результате совместного действия Той-белков. Утилизация крахмала и сахаров таблице 13.3. Рост родительских и рскомбинантного нггаммов Руеиг)ел!слит на разных ароматических соединениях'> Рост мазу Л1пгмм бифеииле дифеиилмепгая зплупле бензпзе зрмялпрзтилеие Р. ргнф КР715 Р.риий Ш Р.
Рпгцйг КЕ715-О5и ч-ч-ч- '! из !марты зпузмз «! з1., л 1ьггеиы 178: 4039 — 4046, 199б, с изменениями. т ! Обпзмзченяяг +++ хпрпияй рост; тч умерснпый рпаг; г пмззпйрпгт! — пчапь папяпй рпсг мам пят роста. 'г и!тамм кг7!уоу Р раааа получая мутям ззмапы ммз ьрь41 я ыммма к!715 яз ып мас1 аз ммммз р!. заменен с помощью гомологичной рекомбинации на кодирукнций болыную субъединицу толуолдиоксигеназы ген гогтС) из штамма Г1 Р. РигЫа, получили пггамм, способный эффективгю разруш пь трихлорэтилен (табл.
13.3). Кроме того, этот штамм рвете~ нн многих ароматических соединениях, а следовательно„есть возможность создания микроорганизмов, способных разрушать сразу несколько разных соединений. Крахмал, основной резервный гюлисахарил растений, представляет собой смесь гомополимеров л-глюкозы — как линейных (амилоза), так и разветвленных (амилонектин). Молекула амилозы состоит из 1 107-4-105 остатков Г)-глгокозы, соединенных сг-1,4-связями (рис. 13.9, А), а амилопектина — из коротких (17 — 23 остатков 1)-глюкозы, соединенных Биолеградапия и утилизация биомассы 287 л ! ! Глюкоза ! ь 1. ! Г Т вЂ” """" " ! ! Глюкоза Дскстрин Лмияоза 1люкоза р-Аиилаза ! ! ! ! ! Глюкоамилаза ! ! г ! ! ! Мкзьтоза Глюкоамяа о-Декстрмн б-Декстрмн Амалоосктмм а-1,4-связями) линейных пеней, соединенных 1,6- и 1,3-связями и формирующих сильно разветвленную структуру, солержашую 1.10з — 4 107 остатков глюкозы (рис.
13.9, Б). Степень разветвления и соотношение между амилозой и амилопектином варьируют в зависимости от вида н возраста растения, из которого был получен крахмал. Промышленное ироизеодетво фруктозы и этоноло Крахмал широко используется в пищевой промьшшенноши и пивоварении; при этом его сначала гидролизуют до низкомолекулярных компонентов, а затем превращают в другие соединения, преимущественно во фруктозу и этанол. Основ- Рис.
13.9. Л Фсрыентативный гидролиз аыизюзы. Б. спермеитативный гидролиз амилопектина. Голубые круж- ки — остатки Гз-глюкозьь 288 13!АВА 13 М ел етое зерно Желирсиаииьй прилуку Охьискдеиис и-Ам ~ глаза Ожижсиинй ивылзег Глюксаиилази Осахареииыа прылукг !лизксзсизимер сжжи Фермситаиия Фруктсзи Эзенол Рис.
(ЗЛО. Промьшглеинос производства фрчктозъ~ н зтанола нз крахмала. ныс ферменты, необходимые для гпдролнза крахмала и дальнейших превращений, — гх-ал1нлаза, Онокоамилаза и глюкозоизомераза. Йх стоимость составляет примерно 3096 обшей стоимости всех ферментов, применяемых в настоягпес время в промышлсшюсти. Промьплленное произволство фруктозы и этиюла из крахмала — эю многоэтапный процесс, включщо!Ний следующие ферментативныс н нсфсрмснтатнвные сталин (рнс. !3.!О). !. Желировш,ие молотого зерна (обычно кукурузного, содержание крахмала в котором составляет примерно 40%). Для этого зерно обрабатывают паром пол давлением, в результате чею разрушаются крахмальные зерна и крвхмы станОвится лоступным хшя послслук)шс! о фрсмснтативною ггглролиза.
Получаемый пролукт имеет жслсюбраз~ ~ую консистенцию. 2. О>кнжсние. Желированный крахмал охлаждают ло 50 — 60 'С и добавляют а-амилазу. При этом происхолит гидролиз лоступных а- 1,4-связей и образуются низкомолекулярные полисахариды. Высокая температура повышает эффективность проникновения фермента в желированный крахмал н увеличнваег скорость гидролиза.
3. Осахарнвание (полный гилролиз) низкомолекулярных полнсахаридов (как линейных„ так и разветвленных) ло молекул глюкозы. Происходит пол лействием глюкоамнлазы. Конечным продукюм такой обработки является глюкоза, нз которой затем можно получить этлнол (с помощью дрожжевой фсрмснтации) или фруктозу (с помощью глюкозоизомсразы). Благодаря высокой эффективности послелнсго нропесса вместо сахарозы при приготовлении пищи и в пивоварснии в Северной Америке используют более дешевую фруктозу. Крахмал при промышленном произволствс фруктозы обычно получают из кукурузы, поэтому сю конечный продукт называют кукурузным сиропом с высоким содержанием фруктозы или просто сиропом с высоким сояержанием фруктозы, хотя он состоит из примерно равных долей фруктозы и глюкозы.
Фермент гх-алшлаза гидролизуст О.— 1,4-связи в молекулах амнлозы и аминопектина слу ши ым образом, при этом образуется смесь глюкозы, мальтОзы (лва Остатка ГлюкОзы, сОслиненные а-1„4-связью), мальтотриозы (три остатка глюкозы, соединенные гх-1,4-связью) и ряд плекстринов, которые прелставляют собой фрагменты амилопектиновых цепей с попсречшлми сшивками (рис. 13.9).
О-Алшлазу можно выделять из многих микроорганизмов, но Лля промышленных целей ес обычно получают из Васу!(из ату!а(й)ие)ас(спь. Иногда для расщепления крахмала вместо <хамилазы нли олноврсменно с ней используют рамилазу, которая гилролизует кажлую вторую О.- 1,4-связгч начиная с коннов цепей амилозы и амилопектина, в результате чего образуются остатки мальтозы н различные )1-т!Скстрины Фермент глюкоамнлаза гидролизует п-(,3-э оэ1,4- и гх-1,6-связуь Олнако и-1„4-связи опа гндролнзуст менее эффективно, чем п-амялаза, и поэтому обычно используется совмеспю с Биолеградация и утилизация биомассы 289 ° ° Получение мультиплазмидных микроорганизмов, способных утилизировать несколько соединений А.
М. Чакрабарчи С. й ра!ет 4,259,444, !9В! пути разрушали определенное органическое соединение. Взяв четыре разные бактерии, он создал один микроорганизм, солсржащнй плазмиды, которые обусловливали лсгралапию камФары, октана, салицилата и нафталина. Эта работа была новаторской и очень интересной не только с научной точки зрения (слелует учесть, что она была проявлена в начале 1970-х !т., ло появления большинства генноинжснерных метолов).
Она сьцрала ключевую роль в официальном признании биотехнологии, поскольку ванное пзо- субстрат. Это будет дешевле, чем получать ферменты из природных микроорганизьюв. ° Использовать разновидности а-амилазы (встрсчагощисся в природе или созданные методами генной инженерии), которые обладают более высокой активностью и позволяют проводить ожнжсние прн 80 — 90 'С. Это ускорит гидролиз желированного крахмала и сэкономит энерпцо, расходуемую на его охлвжчснис до температуры, прн которой обычно проводят гндролнз. ° Модифицировать гены а-алгилазы и глюкоамнлазы таким образом, чтобы кодируемые нми ферме!!ты имели одинаковые оптимумы температуры и рН. Это позволит совместить этапы ожижсния и осахаривання. ° Найти илн создать фермент, который будет эффективно расщеплять необработанный крахмгьт, что позволит исключить этап желирования и сэкономит большое количество энергии.
° Создать такой микроорганизм для фсрмснтацни, который будет синтезировать и сскрстнровать глк>коамилазу, что устранит необходимость сс добавления в процессе фсрментацни. ней. Основная функция глюкоамцлазы — расщепление поперечных сшивок в молекуле,чекстрина с превращением его в глгокозу. Этот н ,чругне ферменты исцользуюгся для уменьшения доли углеводов (дскстринов) в норманы ц гх сортах пиВВ н пОлучсния так назыВасмых сВстлых и сухих сортов. Обработку глк>коамилазой обычно проводят перед фсрмснтацней, однако эти два процесса можно объечиннть.
Глюкоамилазу синтезируют мнопге микроорганизмы, но обычно се получают из грибов АхрегрПиз гггеег. повышение эффективноспги производства фруктозы и этанола Стоимость производства этанола нли фруктозы из молотого зерна в основном определяется стоимостью ферментов, которые обычно используются однократно.
Поэтому разработка новых подходов недорогого широкомасштабного проИЗВОдства этих фсрмснтОВ МОжст сущсстВсннО снизить стоимость конечных продуктов. Этого можно достичь несколькими способами. ° Использовать для свсрхпродукцнн ферментов быстрорастущие рекомбннантные микроорганизмы, угнлизирующис недорогой Ло появления технологии рекомбинантных ЛИК одним из способов переноса генетического материала из одного микрооршц изма в лругой была копъюггцгю!.
'1'акой механизм обеспечивал перенос из клетки в ктетку целых плазмил. А. М. Чакрабарти, проводивший зксцеримснть! по переносу плазмил-еразрушительниплч с. плазмил, колируюших все Ферме!О.ы пути бподсгралации опрелелсшюго соединения, сконструировал штамм, солсржащий несколько таких плазмил. Копируемые плазмилными шнами Ферменты каждого катаболического брешние получило в марте 1931 г,, по пи через девять лет с момента подачи заявления, патент США. После того как Верховный сул США вынес решение в пользу Чакрабарти, создание микроорганизмов с помощью гснноинжснсриых моголов было признано изобретением, которое можно было патентовать наравне с другими.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
