Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 83
Текст из файла (страница 83)
Это решение суда и последующая ел!лича патента сыграли пе менее важную роль, чем салг научный эксперимент, стимулировав развитие биотехиологичсской промышленности. 290 ГЛАВА 13 В настоящее время проводятся исслелования, которые покажут, возможна ли разработка таких полхолов. Гены, кодирующие а-амилазу, были вылелепы из многих микроорганизмов, в том числе из В. ату1о1111ие1ас>е>лг и тсрмофильпой бактерии В..»геагоВгсгтор)н1и>1 Для этого экстрагировали их хромосомну>о ДНК, час гично гидролизовали се рсстрицирук>щей энлонуклсазой ЯаиЗА1 и встроили в обработанную рестриктазой ВатН( плазмилу рОВ!10, которая солерж!и уникальный ВатН1-сайг и несет ген устойчивости к канамицину. Полу!енным банком клонов трансформировали не обладающие 5х-амилазной активностью клетки В.
гиЫ11П отобрали трансформированные клетки по признаку устойчивости к канамицину и тестировали их на способность к синтезу и секреции о>-амилазы при помощи иод-крахмального теста. Для этого чашки с колониями, образованными трапсформантами при 65 С на содержащей крахмал твердой среде, поместили в пары иода.
Колонии, пролуцнрук>щне О-амилазу, были окружены четко разлнчилгым гало, что свидетельствовало о гидролизс крахмала вблизи них. Положительный иол-крахмальный тест указывает на транскрипцию гена и-амилазы под контролем своего промотора (вектор нс солержит промотора) и па наличие сигнала, необходимого для секреции (молекулы субстрата велики и не могут проникнуть в клетку). Возлюжпость получения генов и-амилазы из раз>!ых источни- КОВ пОзВОлил' ! исщ1елОВател5!м Внести В них изменения, необходимые для топь чтобы эти гены можно было использовать в конкретных промьпиленных процессах. Возможность искпочсния этапа осахаривания при произволстве этапола из крахмала была Показана следующим образом.
Выделенную из грибов Азрегх(11их ал«атоп' полноразмерную кДНК глюкоамилазы встроили в Овну из плазмил 5асг1>аготус!я сеге> 1х>ае та к, чтобы она нахолилась под контролем промозора и рсгуляторных послело!гатсльностсй терминации транскрипци51 сена енолазы дрожжей (ЕА>01). «Лабораторныи» ппамл! В.
сеге>111ае, трансформированный этой плазмилой, приобрел глюкоамилазную активность и мог превращать растворимый крахмал в этан ол. К сожалению, нскоторыс свойства этого ппамма (чувствительность к высокой концентрации этанола, неэффективность экспрессии кДНК гл!Окоамилазы, ПОЛЛержанис плазмид только при опрелеленном давлении отбора) лелают его непригодным для промышленного использования. Очнако эти недостатки улалось устранить.
Во-первых, продукцию глюкоамилазы повысили примерно в 5 раз, улалнв из плазмиды область отрицательной регуляции ЕФ01-промотора длиной ! 75 п. н. Во-вторых, нз плазмилы удалили «дрожжевой» сайт инициации рспликации и встроили в нее сегмент ДНК, голюлогичпый участку дрожжевой хромосомы, превратив ее тем самым в интегрирующий вектор, который всграивастся в лрохсксву!о хромосому и стабильно подлерживается в клетке.
В-третьих, в качестве клетки-хозяина для модифицированной таким образом плазмилы использовали другой ппамм 5. сегеггх)ае (пивные дрожжи), устойчивыи к высокой концентрации этанола. В результате получили два новых штамма дрожжей, которые гидролизуют и фермснп>рук>т растворимый крахмал более эффективно, чем близкис к В. сегегс»1а» природные алгилолитические (гндролизующис крахмал) дрожжи х г(1азгаВгих (табл. 13А). «Пивной» пгшмм Х гоге»1хгае с встроенным в хромосому геном глюкоамнлазы дсйствовш1 более эффективно, чем кчабораторный» с тем же геном в составе м!югокопийной плазмиды, что, по-вилимому, свидетельствует о се нестабильности и утрат!.
Ввслснного гена глк>- коамилазь!. Как «лабораторный», так и «пивной» штаммы 5'. сегегл»1аело введения в ннх гена глюкоамилазы не могли утилизировать растворимыйй крахмал. Плазмндная и интегрированная кДНК глюкоамилазы А. а>«атог>' находилась под контролем регуляторных последовательностей гена ЕА>01, отку»ла бь>ла удалена область отрицательной регуляции ллиной 175 п. и. Для по>ьтержания плазмиды создавалось опрелеленное селсктивное давление. Для ИОВЫ!Лени>1 прОлукции Глк>КОамилазы в хромосомную ДНК грибов А.
В>Лег встроили несколько копий ес гена. Оказалось, что активность глюкоамилазы нс коррелирует с числом копий гспа, но силыю зависит от топь в какой участок хромосомы онн были встроены. Такнл! образом, простого увеличения числа копий гена 5 аблияа 67.4. Расщспззсннс растворимого крахмала (25%, в/о) разными штамыамн дрожжей'5 Мсилизизитл углеводов, тс Првизввдсзвв втдиилв, г/л Выход эзиивлв, с/г субсзрвтв 0 0,4! 0 0,40 0,38 «Лвборвтор ны Яи еЛвбврвзврныю + тыазмндв Пивной» зПнвной»+ встроенный ген Х с!еж!и!!сиз <0.1 75,6 3,! 5!В,2 44 2 5 ба <! 93 43 " Из работы Сс)е с! в1, Лсттесдисзтюб 417- 421, !98В, с измсисниими.
5!сдостаточно для повышения продукции активного фермента. Фсрмспт глюкозоизомсразу следовало бы назвать ксилозо/глкткозоизомсразои, поскольку основная катализируемая им реакция — это превращение пятиуглеродиого моносахарипа 13-ксилозы в Пыксилулозу, а реакция изомсризации (3-глюкозы в (3-фруктозу является побочной. Ксилозо/глюкозоизомсраза имеет бо- Лес ППЗ«УКЗ Катюзптих5ССКУЮ КоистаитУ 1~си! 5! более высокую константу связывания /с„з для глюкозы, чем для ксилозы; это означает, что ксилоза прочнее связывается с ферментам и быстрее преврпцается в ксилулозу, чем глюкоза превращается во фруктозу. С помошькз впутрпклсточпых ферментов, к которым относится ксилозо/глюкозоизомераза, пе удается получать продукп ! такой жс степени чистоты и в таком жс количестве, как в случае виеклсточиых (секрстируемых) ферментов.
Большинство ферментов, используемых в промышленных процессах, ие подвергаются ппательной очистке, а в препарате впсклеточиого фермента обычно содержится гораздо меньше бслкОвых примсссй, чем В экстрактс Внугриклсю шого. Кроме того, для полу !ения экстракта внутриклсточпого фермента необходимо отделить клетки от культуральнои среды, мсхапически их разрушить и удалить образовавшиеся фрагменты. Все это повышает стоимость конечного продукта -- ксилозо/!люкозоизомеразы.
Чтобы решить эту проблему, можно иммобилизовать фермсиз иа твердом нос!пеле и использовать его миогокрапю. Изомсризация глюкозы с образованием фруктозы — обратимая рсакз!ия, ко!!ечиое содсржапие образузошейся в ее ходе фруктозы !заходится В прямой зависимости от температуры, которая в большиишве производствсзшых про- Б5!Одсграддпия н утилизации биомассы 29! цессов составляет примерпо 60 *С. Повысив температурный оптимум и термостабильность ксизшзо/глюкозоизомсразы, можно увеличить выход фруктозы.
1 срмофильиая бактерия Т(зегш545. 5)тесто/57!В!с! продуцирует ксилозо/глзокозоизомсразу, которая сохрапяет свою активзюсть и остается стабильной при 95'С, а потому представляется весьма перспективной для промышленного использования. К сожалению, приролный штамм Т. ВзегторЬ!мс вырабатывает сс В небольшом количестве. Чтобы устраиить этот недостаток, выделили ген ксилозо/глюкозоизомеразы Т. Г/зегторМш и осушествили его !кспрессию в Е. сой и В.
(згезсз с использоваписм разных промото- 15ОВ и разиых саитов связывания с !зибОсОмой (табл. 13.5). В последней из представленных в табл. 13.5 систем фсрмеит вырабатывался в количестве, более чем в 1000 раз прсвьпдающем исходное, 'по позволяет использовать ее для промышлсшюго получения фруктозы. Есть еще олив возможность — повысить субстратиую специфичность фермента. В одной из серий экспериментов с помощью сайт-специфического мутагеиеза заменяли нуклеотиды,копирую!лис одну или две аминокислоты ксилозо/глюкозоизомеразы термофильиой бактерии С(ос!с!Бит Взеглзоси(/йгокслсс; Выбор сайтов длн модификации основывался иа даипых об участии соответствузосцих амизюкислот в связывапии субстрата.
Замена триптофаиа в положе!!ии 139 на фенилалаиип или валина в положении 186 па треоиии привела к повышсцизо каталитической эффективности (к,ы//Свз) феРмеита В отиошспии юпокозы в 1,7 и 2,6 раза соответственно (табл. 13.6) и к ес умсиыпспию для ксилозы в 2 и 7 раз. При одновременной замене двух амииокислот каталитическая эффективность в отношении глкзкозы повысилась в 5,7 раза, а в от- 292 ГЛАВА 13 Тиб»гила 733 Активность кс>олозо7глюк(лзоизомераз! ! Т. 17!егин>р7>!!!о в разных бактериях> Бяку срняз> Числа калий пзязмн;пя 11!юмо»ор Сяйт сяязыяяннн с Рнбосомай Ферментюзмняя яктнянасззи КДуя 7: !бог»иор>В1из Е.
сой >ис. Т. салюс Е. сой !ис (!>я» Т7 ПО В. Лге»ю гнр В. Ьге>к> сн> Т. гйепиор1и!из Е. сой Е сай Е, гой Е. сай В. Лггнг В Ьгенз Т. >Ьегиюр>и!»о Т тет»орыйи> Т. !Нсно!»Рг»й!»з Е сай 10 сай Т. глегюгрги1ио д Лгсмо ! 1сг 200 20 20 20 70 20 20 !90 1 790 3 260 7 050 1 400 25 000 » Из иос»иь» Ое!»Лн е! о!..
4рр!. Ябсюорй В»оис!мо1. Зе» 727 732. 1992. с н»ыснсниюе» з> ленные. прноеяеон не е иероай спюке. и» пася гся к пряра»и>ам> ш> ям му, ораз>инруююеыу ион нын еюрые»п. Все астел ные ипеммы ис» учен ь» иу»еы урон» фар»»»»ин» о саеерке»»е» ~ ксююю!»люказоы»омеряхы 7»яеиооря»1о» о сас мое мур ьгнкапяяной ю»о»мюю Таблица 73.6. Кнталитическзя эффективность природной и мугантиых форм ксилоэо/глюкозоизо- мернзы С. (йоги>ахийитйспсз» Зямены ямннокнслиг Казня»п ячесКяя эффекта янаеть й „/й и мнн->.мМ-> глюкозе фруктозя Нет (»>Рпролняя) Тор-139 -> Рйе Уя1-186 — » Тйг Тгр-139 -> Рйе/У01- 186 — > Тйг 97,2 13,6 55Л 21,6 5,Ь' 15 9,7 32,9 '> и» роба»ы меаз е! я!., рик ио»! лсы! 5»! 054 аи 40!54019. !99!.
с изменениями Табл>»аа 73.7. Сравнение Х тоЬ»7о и Х сегер>зйис как пролуцснтов эта> >ела'> Покяэятеяьз> Зняченне ляя: Х»иоЬ»1Ь Е сегео(иое 11реаря ще нос се хере я этан оя, % 96 12 12 Мякспмяяьняя кот >ен тря им эта паяя. % 5,67 Скор»кть праяукпнн этя>юяя, > г '. ч ' (>б>юл»няя скорость пролукпнн э>янояя, г-л ' ч ' >40 Допустимая кою(ентряпня сяляря. % 2 6,5 30 .ЗХ Дняпяюн р!1 (>пп>мяяьпяя темпера гура, "С 3,5 — 7,5 25 — 30 '> И» >н(югы Висййа>г с» о!., 7мойо ф» марио!. 5» >99 — 204, >987 > С корсо» ы»роиу хин о» гм ~ояо языерюм и *»яняоргн их усяаеоях»»ыр мантеньи. ао» сын ую с лап»с» ь — о попре ры онан к>л ьтяю.
но!пении ксилозы снизилась в 4,5 раза. Таким образом, двойная замена привела к тому„что фермент, который исходно был в 17 раз активнее в отношении ксилозы, стал в 1,5 раза активнее в отношении глюкозы Изменение специфичности и повьппение тсрмостабильности ксилозо/глюкозоизомсразы, которого удалось достичь, позволит использовать сс лля промышленного превраШения глюкозы во фрукгозу. 7угло>лаг!ат лто(и715 Сбраживание субстрата при промышленном производстве этанола осуществляют в основном с помощью о. сегерйт!ае, но вместо нее можно было бы использовать бактерию кутал>опар глоЬ!714. 2!То грамотрицательная палочка, которая сбраживает ппокозу, фруктозу и сахарову с относительно боль!пим выходом этанола (табл. 13.7). По-видимому, это связано со снижением се пролиферапии (прироста биомассы) в хоЛе ферментапии и уменыленисм количества расходуемого на зто субстрата, который теперь идет на образование этанола.
Расщепляя 1 моль глюкозы„дрожжи вырабатывают 2 моля АТР, а использующая другой метаболический путь 7утотолаз — 1 моль. Исторически сложилось так, что гул>отавах использовали лля ферментании при производстве алкогольных напитков в тропических странах (например, в Мексике лли производства напитка, называемого пулька, который содержит 3 — 5% спирта и вырабатывается из сока агавы). Ос! ювное различие л(ежау гутотог>ау и Х сегерй>!ае как проЛупснтами этанола заключается в скорости его образования.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
