Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 84
Текст из файла (страница 84)
У Ууто!лолах она горазло выше (табл. 13.7). Олнако сушествуют некоторые биологические и технические ограни- Ьиодеграгация и угилизация биомассы 293 грзА гаг р'"" ху!д Рнс. 13.11. Челночный вектор Уутатапаг — г.. Сай, нЕСущИй дви ОИЕРОца, ОЛин нз котоРых содержит гены ферментов, необходимых лля утилизации ксилозы (ху1А и хугй), а другой — гены ферментов, участвующих в метаболизме пснтозы (ЖгА и гаг). Стрелками укжлано направление транскрипции с каждого промстори р""' — промотор гена снолазы, ртг — процотор гена глицсрильлсгид-З-фосфатдсгидрогспазы, ху!А — ген ксилозоизомеразы, ху11г — ген ксилулокинизы, гугА — ген трапскстолазы, га1 — гси трансальдолазы.
лег ' — геп устойчиности к тстрапиклину, ап" — гочка инициации репликации Е. сад. ДН К Уутапгапах содсржит собственную 'точку инициации репзикиции. чения, не цозволягощие использовать /утатаггал гшя промыв!лсннОГО прОизночстна зтипола 1) небольшое число углеродных субстратон, которые она может использовать для с и нтсзи эланола; 2) проблемы, нозникакгщис при полдсржании н ней гсюнируюпгих нскторон с широким кругом хозяев, а значит, и гужсродных генов; 3) приролная устойчивость к наиболее распространенным антибиотикам, гто не позволяет при 11роведении эксперимснтон по клонированикг использоглать спгндартные марксрные сисзеыьг устойчивости к антибиотикам.
Несмотря на нес это ученым удалось встроить и экспрессировить в Уупгатагган ггекоторыс чужеролные гены. Большинство проведенных зкспсримснтон были напранлспы ца расширение спектра утилизируемых сю субстратов. Так, в Уутотапаз были введены гены ферментов, гидролизующих лактозу, крахмал, целлюлозу, ксилозу и целлобиозу. Тршгсформированныс клетки экспрсссировали все эти гены, но в большинстве случаев нс могли использонить псречислснныс н цце субстраты в качестве единственного источника углерода. Придать Уутггтаггах новые катаболические свойства оказалось весьма непросто, хотя по крайней морс в одном случае удалось использонип этот микрооргвгизм для получения зтанола из отходов, содержащих ксилозу.
В самом начале работы по созданиго штаммов Х тоЬй(з, способных расти и продуцировгпь этанОл с испОльзОванием ксилОзы н качсствс субстрата, в эту бактерию ввели гены глюкозо/ксилозоллзомеразы и кснлулокипазы — ферментов, необходимых для утилизации ксилозы. Но полученные трапсформанты lе могли использовать образутощиеся при расщеплении ксилозы пснтозы (кснлулозо-5-фосфат, рибулозо-5-фосфат и рибозо-5-1)юсфат). Поэтому ни следующем этапе в У.. таЬ(йз ввели плазмиду, ггесущую,чва синтетических опсрони„о,цлп глз которых кодировал дна фермента, расщсплякяцих ксилозу, и другой — два фермента, метаболизирующих псптозу (транскетолазу и трансальдолазу) (рис.
13.11). Транскрипция генов первого опсрона находилась под контролем сильного конститутивного промотора гена гпицеральдегид-3-фосфатдегидрогсназы У.. таЬй(з, а второго — под контролем промотора гена снолизы У. таЬй(з. Эти два синтетических опсрони встроили н чел ночныи вектор гб сай-У.. таЬгйх, которым и трансформировали У..
таЬйнв Кик и ожидалось, трансформированные клетки утилизировали ксилозу и преобризонывали пентозы до фруктозо-6-фосфата и глицеральдеплд-3-фосфата, которые затем преврацлались в этанол по пути Энтнера — Дудороффа. Ьолсс того, трансформанты эффективно росли на глюкозе, ксилозе и их смеси и превращали ксилозу в этинол с большим выходом посггеднего. Эта работа продемонстрировали возможность гснноинжснср- 294 ГЛАВА 13 ной молифнкации У.. тоЬ!)й для создания микроорганизма — продуцснта этанола, который использовал бы В качестве источника углерода ксилозу, побочный продукт дерсвообрабатыва!ошей и целлюлоз!ю-бумажной промышленности.
Получение силоса Такие сельскохозяйственные культуры, как кормовые злаки, кукуруза и люцерна, широко используются в качестве корма для скота, поэтому очень важно обеспечить правильныс условия их хранения в течение мноп!х месяцев. Традиционно для этого применяют природные молочнокислые бактерии, для которых рас!Нтсльный материал служит субстратом при синтезе молочнои и уксусной кислот. Эти кислоты подавляют рост других микроорганизмов, способствуя сохранению кормовой растителыюй массы (силоса). Если молОчнОкислые бак!Срии присутстВуют на свежем растительном матерь!Вле в небольшом количестве, нужэ!о добавить бактсриалы !ый посевной материал (обычгю ТасгоЬас!Лиг р(атагит), К сожалению, эта мера Оказывается малоэффективной в тол! случае, когла растительная культура содержит недостаточгюе для подлержания роста бактерий и производства молочной кислоты количество вочорастворимых углеводов.
Для создания бактерии, способной осуществлять эффективную ферментацию растительного матсриг.!а, встроили гси ц-плазмиды «пе снлоснОГОь штамма 1.. ату(0!Оуи5 в хроыОсОмныи гсн конъюгированной гидролазы жсл гных кислот (СЬЬ) Одного из штаммов Е. р!атагит (рис. 13.!2). Этот ген кодирует фермент, который активируется при попадании бактерии в кишечник животного и, следовательно, нс нужен при образовании силоса. Данная работа представтшст собой первый шаг па пути создания штаммов Е. р!он!агат, способствукицих более эффективному образовании! силоса из ссльскохО35пяственных культур!, сОдержащих мнОГО крахмала, таких как люцерна. Утилизация целлюлозы Структурный каркас почти всех наземных растений состоит из полимеров: лигнина, гемицеллюлОзы и целлюлОзы.
Объсдин5!5!сь В разньгх таблица 53.8. Состав разных лигнопе5ьяюлозных материалов" Содержание, % Сырье 26.0 44.0 !9,5 39,0 15,9 33.4 30,0 12,5 24,0 32,! Не содержит ж! — 95 Хлопок '! Из р«ао«я Вго«о, РЫ!аь 2«оо«К зоа го«я Е. 3ОО: 305- 322, !983. пропорциях, они образу!от лигноцсллюлозный материал (табл. 13.8), на долю которого приходится основная часть биомассы, остаюшейся в огромном количестве в виде отходов сельского хозяйства, лерсвообрабатываюшей промышленности и других отраслей хозяйственной деятелыюсти человека.
Эти отходы необходимо переработать или !использовать в качестве промышленного сырья. С этой точки зрения ли1- ноцеллюлозные материалы можно разделить на три класса. Сами растения, специально выращивасмые лл51 пОлучсния цсз! нОЛОзы, сцзОительных материалов или корма для скота (хлопок„чревссина, сено). Растительные отходы, остающиеся после сбора и 1!Срсработки урожая и после обработки древесины (солома, рисовая и!елуха, багасса сахарного тростника, древесная шепа, опилки и т.
Л.). Бытовые отхолы (использованные бумага, картон и т. д.). Кол!5!Овен!!!ы лигног4елл!ализы Л игпин — глобулярный 1!Срсгулярный нерастворимый полимер (мол. масса > !О ООО), состояший из остатков фснилпропана (рис. 13.13). 154олекулы этого ароматического вещества прн образовании лигнина соединяются друг с другом случай!И!и образом с помощью разных химических связей, нс поддшощихся фсрментатншюму гидролизу нли химическому расщеплении!.
У расте- Сое! !паяя древесина Верезомя древесина На!асса сахарного тростника Рисовая солома лагина даллив5аза гемидаляииаза Кроссииюнер Ген сЬЬ Плазмидиая ЕгаГ сЬЬ о-амипалы гбл Виугрикромссомный двойной кроссиигоьер между генами гЬЬ Ген сЬЬ и-алотазы сЬЬ ний лигнин образует комплекс с гемицеллюлозой, в который заключены проводящие пучки.
Лигнин обусловливает ригилность растений, а также их устойчивость к механическим повреждениям и действию микробов. ГЕМИцЕЛЛЮ1ГОЗЫ вЂ” зтО КОрОтКОцЕПОЧЕЧНЫЕ гетерогенные полимеры, состоящие из гексозных (шестиуглеродпые сахара, такие как глюкоза, манноза и гилактоза) и пентозных (пятиуглеродные сахара, такие как ксилоза и арабиноза) единиц. Все гемицеллюлозы можно разделить на три основных типа: ксиланы, остов которых состоит из молекул поли-1)-1,4-ксилана с присоединенными к ним арабинозой, глюкуроновой н арабиноглюкуроновой кислотами; маннвны, состоягцие из глюкоманнанов и галактомвнианов; арабиногалактаны.
Гип гемицеллюлозы обычно зависит от ее происхождения; так, ксиланы обычно содержатся в твердых сортах лрсвесины, а глюкоманцаны — в мягких. Целлюлоза, наиболее простой компонент лигноцеллюлозы, является самым распространенным природным полимером. Его длинные Рис. 13.12.
Ввеление гена аамилвзы в хромосому Е. р1алгагат. Ген а-амилазы встраивают в геп сЬЬ челночной плазмнлы Е. сад — Е. р1алгагат, которой затем трансформируют клетки Е. р1атагит. В рсзупьтвтс кроссинговера между гЬЬ-покусами плазмидиой и хромосомной ДНК образуюгся клоны Е. р1алгагит„устойчивые к зритромицииу и обладающие а-амилазной активностью. При выращивании транс4лормированньлх клеток в зечсние достаточно длительного времени (не менее 30 генераций) в неселективных условиях может произойти внутрихромосомпый двойной кроссинговер, приводящий к злиминации гена устойчивости к зритромипину Егт', хромосомного гена сЬЬ и плазмидиой ДНК.
Виолегралацив и утилизация биомассы 295 цепи состоят из остатков Г)-глюкозьг. соединенньтх 1$-1,4-связягии (рис. 13.14). При гидролизе из целлюлозы, как и из крахмала, образуется глюкоза, но сами эти исходные вещества имеют разное строение. Крахмал — запасаюшая энергию молекула, остатки ппокозы в которой соединены так, что полимерные цепи не могут располагаться упорядоченно и образуют сетчатую структуру, легко пропускающую воду; поэтому он растворяется и воде и легко гидролизуется амилазами и глюкоамилазами. В целлюлозе полимерные цепи упакованы так, что образуется кристаллоподобная структура, непроницаемая для воды; поэтому целлюлоза не растворяется в воде и устойчива к гидролизу.
Целлюлоза — очень ценный материал, из которого можно получать множество продуктов (например, зтанол). Но сначала необходимо высвободить ес из комплекса с лигнином и гемицеллюлозой. Для этого можно обработать лнгноцеллк>лозный материал сильной кислотой или сильной щелочью либо подвергнуть его действию высоких температуры и давления. В лю- 29б ГЛАВА 13 н сон ! НС— ! НСОН Нгсон ! НС ! НС вЂ” О ОМе ОМе НгСОН ! О ОМе сн ! СН ! НСОН ОС ! НС ! НС Н,СОН О ! НСОН ОМе О— — О ОН методы избирательного химического и фермен- тативного расщепления лигнина.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
