Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 81
Текст из файла (страница 81)
Эта работа показала принциинальну!о возможноси, создания пснхрофильных штаммов бактерий, эффективно разрушающих ксепобиотики в природных условиях, иодля их реального получения нсобходилю провести дополнительныс исследования. Изменение генов Обьединение разных метаболических путей в одном микроорганизме с помощью конъюгацин— это лишь один из способов создания бактерий с новыми свойствами. Расширить их катаболические возможности можно и другим путем, модифицируя гены, кодирующие ферменты того или Рве. 13.5.
Создание бакгериального штамма. способного разрушазь камфару, лзктлн, ксилол н нафталин. Шталзч А, несущий илазмнду САМ (она летерминирует разрушение камфары), скрещиваю! со шламмом В, несущим нлазмилу ОСТ (разрушение октава). При этом образуешя лвтамм Е, который содержит гибриднукз плазмиду, образовавшулеся в резулыате гомологичной рекомбинации между исходными плазмидами и облазаю!цую функпиями каждой нз ннх. Шглчч С, солержащий плазлзилу ХУ!. (разрушение ксялола), скрещивают со шзвччом О. содержали!ч нлазмиду )ЧАН (разрушение нафзалина), и получаю! штамм Е, которьлй несет обе этн ила!милы. Наконец, скрещивают нпвммы Е и Г, в резулшате чего образусзся штамм О, содержащий плазмилы САМ/ОСТ, ХУ!.
и Л!ЛН. 282 ГЛАВА! 3 Тиблгзца 13.2 Время генерации дикого и трансформированного психрофильпых штаммов Р. Риг1г(а, использую- щих н качестве елипствешнзго не!очипка углерода сювицзшнт или толуат, при разных температурах' ! Температура, 'С Время генерации, ч траисформиронанныа ппамм, снлнцнллт грансформиронанпыа пзтнмм, толупг итямм дикого типа, ызлипила гзз Не рнпгет 2,2 2,1 2,6 3,2 6,3 !3,9 10,6 Не растет 2,0 1,3 1,9 2,9 3,3 12,2 24,4 Нс растет 2,5 3,2 3,8 4,2 5,6 12,9 1Х,! 37 30 25 20 15 10 5 0 ~З Из работы Книпс ез а!., АррА. Енпгоп. Мггголге!. 54з 638 — 64г, 1988, с нзлзененннми. з' Ш тем м ликопз типа не мсмгз зтнзнзиропзгл толуэт ни при «злоа темперпуре, поскольку у него зпсугспзукт иесбкслнмые ллн этою 4мрмггззлл иного метаболического пути.
Осуществимость этого подхода проверяли на примере плазмиды рУУ9УО, 12 генов которой кодируют лгета-рас!цепление толуола и ксилола. Обладающие этой плазмидой псевдомонады могут использовать в качестве источника углерода алкилбензоаты (рис. 13.6). Указанные гены вход!ту в состав одного ху1-оперона, находящегося под контролем Р -г!ромотора. Транскрипционная активность последнего находится под позитивным контролем продукта гена ху1о, активируемого почти всеми субстратами данного метаболического пути (например, бензоатом и 3-метилбензоатом) (рис.
13.6). Детальный биохимический и генетический анализ показал, что несущие рту%0- плазмиду бактерии могут расщеплять 4-этилбензоат только до 4-этилкатехола, который инактивирует один из основных ферментов данного метаболического пути, катехол-2,3-диоксигеназу, являющуюся продуктом гена ху!Е, и поэтому не разрушается и накапливается в среде. Кроме того, 4-этилбензоат, в отличие от остальных алкилбензоатов, не активирует Ху15-белок; поэтому, если он является единственным субстратом„ху1-оперон не транскрибируется. Для усовершенствования природной системы мета-расщепления алкилбензоатов необходимо решить две основные задачи: 1) предотвратить инактивацию катехол-2,3-диоксигеназы 4-этилбензоатом; 2) инлуцировать транскрипцию генов ху1-оперона в том случае, если единственным субстратом является 4-этилбензоат.
Для решения второй задачи бьи проведен поиск мутантной плазмиды. Для этого в плазмиду, несу!цую ген устойчивости к ампициллину, встроили ген устойчивости к тетрациклину, находящийся под контролем Р -промотора. В другую плазмиду, несущую ген устойчивости к канамицину, встроили ген ху1о. Полу"!енными конструкциями транс!!юрмг!ровали Е. со11, отобрали клетки, содержашие обе плазмилы, по признаку устойчивости к ампициллину и канамицину (рис. 13.7, А), обработали их мутагеном этилметансульфонатом и вырастили на среде, содержащей тетрациклин и 4-этилбензоат. Растущие на этой среде клетки содержат мутантный ген ху(о и продуцируют измененный Ху!$-белок (Яе)„который способен взаимодействовать с 4- этилбензоатом и активировать транскрипцию гена устойчивости к тетрациклину.
Чтобы решить проблему инактивации катехол-2,3-диоксигеназы, мутантный ген ху15 встроили в плазмилу с широким кругом хозяев, несущу!о ген устойчивости к канамицину, и ввели ее в клетки Р. риуЫа, содержагцие плазмиду р'ту'%0 (рис. 13.7, Б). Трансформированные клетки высеяли с высокой плотностью на чашки с минимальной средой, содержащей 4-этилбензоат в качестве единственного источника углерода, канамицин для отбора клеток с плазмидой и этилметансульфонат. Клетки, растушие на этой среде, вырабатывают измененную катехол-2,3- диоксигеназу, которая не ингибируется 4-этилкатехолом. Дополнительный анализ подтвер- Ьиодеградация н утилизация биомассы 283 он о слюн сион l ссон сга он он о С) —.„ л л л н л а ху!Гнироиогср транскрипция Рнс.
13.б. Пу>ь л>ета-расщепления толуояа и кснлола и хуУ-оиерои плазмиды р>У>УО. луУ-Оперои находится под контролем Р„-иромотора, который регулируется с помощью продукта гена ху(о, а см>ю очередь актиаирусмого одним из исходных субстратоа. Гены луУХ вЂ” хуУН находятся под контролем Р„-иромотора. Геи хуане входит в состав оиерона и зкспрессируегся конститугнвио. Исходным субстратом может быть бензоат (К я К' — зто Н), 3-мгянлбензоат (К вЂ” это Н, К' — зто СН ), 3-этилбеизоат (К вЂ” зто Н, К' — это СН,СН ) и 4-метилбензоат (К вЂ” это СН, К' — эго Н). Гены ху(л'Уе кодируют золуолдиоксягеиазу, хуУà — дигидрокснзииюк>гексатггенкарбоксилатдегидрогеназу, л»УŠ— каталан-2,3-диоксигеназу„хуУР— гндролаз> полуальдегнд» гндроксимуконовой кислоты, ху)6 — дигидрогепазу полуальдегида гидроксныукоиовой кислоты, хуУН вЂ” 4-оксалокротонат-таутомеразу, хуН вЂ” 4-оксалокротоиатдекарбокснлазу, хуЦ вЂ” 2-оксопента-4-еиоатггьдратазу„хуУУà — 2-оксо-а-гг>дрокснпентона>зльдолазу.
дил, что в гене катехол-2,3-диоксигеназы рЪ(У>>УО лействительно произошла мутация и что два мутантных гена (ху(о и ген катехол-2,3-диоксигеназы) обеспечивают расщепление 4-этилбензоата, Оба модифицированных гена участвуют в процессе деградации всех субстратов данного метаболического пугн. Поэтому стратегия, использованная для повышения эффективности расщепления 4-этилбензоата, применима и в случае других соелиненнй: мугация, приводящая к гнпериродукции ХуЬ-белка, может усиливать активацию Р- промотора и повышать скорость разрушения субстрата; кроме того, можно избирательно модифицировать Р -промотор, чтобы он стал более сильным, сохранив способность взаимолействовать с Ху)Б-белком. Таким образом, проведенная работа показывает, что вполне реально усовершенствование того или иного катаболического пути с помощью технолопги рекомбинаитных ДНК, традиционного мутагенеза и соответствующих методов отбора.
Одним из наиболее распространенных веществ, загрязняющих почву н воду, является трихлорэтилен, широко использукицийся в качестве растворителя и обезжирнвающего средства. Он длительное время остается в окружающей среде и считается канцерогеном. Кроме того, анаэробные почвенные бактерии могут дегалогенировать его, превращая в еще более токсичное соелинение винилхлорид. Было показано, что некоторые штаммы Р, риГУсга„разрушающие ароматические соединения, такие как толуол, разрушают и трихлорэтилен.
С помощью проведенных генетических исстедований удалось установить„ что для полной детоксикации трихлорэтилена не нужны все ферменты мети-расщепления коппола и толуо- 284 ГЛАВА )3 Музагенее вырашггаание на среде солержашев 4-этилбенюат и тетра~н1клнн Е год Г Рис. 13.?. А. Созлангие сисземы спин еза Ху(8- белка, активирусмого 4-этплбензоатом. Сначала заменяют промотор гена устойчивости к теграцнклину в плазмиде рВКЗ22 Р -промотором и получают плазмнду р)ЕГс200. Затем ген худ с собственным промотором встраиваап в плазмиду с широким кругом хозяев, несугпую ген устойчивости к канамицину.
Полученными плазм идами трансформируют Е сей. Отбирают трансформированные клетки по признаку усгой ыгвосги к ампициллнну и канамицину и подвергают мугаген ному действию зтилметансульфоната. В клетках, несущих мучантный ген ху(о (8"), Ху! Я-белок активируется 4-этилбензоатом ()Б), активируя в свою очередь Рч;промогпр, поэтому они мочгуз расти на среле, содержюцей 4-этилбензоат н тетраццклнн. л я' Рряяаа Му~в!свез; вырвщиввиг!е !щ среде, мгдержвв?сй 4-этняаеи?св? в кэнзмяцян ЭБ Рря?мс ла, достаточно лишь толуолдиоксигеназы, которая в норме катализирует реакцию окисления толуола до лис-толуол?(игидродиола. Образование функциональной толуолдиоксигеназы кодируется четырьмя генамн (рис.
! 3.8, А). Их выделили и:?кспрессировали в Е сой под контролем сильного ипдуцибельного Гас-п)юмотора, который активируется изопропил-В-П-тио?тьтактопиранозидок! (ИПТ1), в результате чего трихлорэтилен разлагается до безвредных соединений. Исходная скорость дсградапии трихлорэтилена в Е сай ниже, чем в Р. риггг(а„нг? она сохраняется в Е сайдолыце. С этим различием может быть связана меньшая, чем у Р. риг?с?а, чувствительность Е сай к по)?ре?кдак?!!!ему действию трг!х??орзт?!лена. Рис. )3.7.
(Цюдслэ!сг???агу Б. Создание системы синтеза мгдифицированной катсхол- 2,)-??иоксигсназы, которая нс ингибирустся 4-этилкатсхолом. Ш?ах?л! Р. 2?и(Ыа, несущий плазмиду русууО, ?рапсформирук?т плазмилой с широким кругом хозяев, содержащей мутантный ген ку(бт. продукт которого активирует Р„-промотор. Проводя!г химический мутя?снез трансформированных клеток и выращиваю? их па минимальной среде, содержащей 4-:липбеязоат и каналщцин. Клетки. растущие нв этой среде, содержат мугантиый ?сн катехол- 2,)-лиоксигсназы (мутация Х в ссрслиис хуроперона). Ьиодеграаапия и утили?алия биомассь! 285 В одном из вариантов .пото эксперимента был создан рекомбинш!тный цггамм Рхсш!ото??ах, в котором бьши объединены элементы двух разных катаболических нугой.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
