Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 76
Текст из файла (страница 76)
Та- ко цефалоспорин С. Один из этих генов был прелставлен кДНК гриба Гизанггт зо)апг', копирующей оксилазу О-аминокислот, а другой происходил из геномной ДНК Рзеиг!агпопаз атттига и кодировал цефалоснорннацилазу. В нлазмиле гены находились нод контролем цромотора А. сагулоуепит. На первом этапе нового бносннтетнческого нуги цефалоснорнн С превращается в 7-В-(5-карбокси-5-оксопеитанамгщ)цефалоспораповую кислоту (кето-АО-7АСЛ) нрн гюмощи оксилазы Р-аминокислот (рнс.
12.17). Часть этого продукта, вступая в реакцию с пероксндом водорода, одним нз побочных продуктов, превращается в 7-!)-(4-карбокснбутанамид)цефалоснорановую кислоту (ОЕ-7ЛСЛ). И цсфалоспорнн С, и кето-А(У-7АСА, н Сг1.-7АСА могут подвергаться ггщролизу цефалосцорннацилазой с образованием 7АСА, однако только 5% цефалоспорина С напрямую гндролизуется ло 7АСА.
Следовательно, лля образования 7ЛСА с высоким выходом необходимы оба фермента ири низком содержании растворенного кислорода (нримерно 5% от насьццающей концентрации), синтезировали в 1О раз болыне актннородина ца 1 г сухой клеточной массы н имели большую скорость роста, чем нетрансформированные. Этот подход можно использовать и для обеспечения кислородом других микроорганизмов, растущих в условиях недостатка кислорода. Исходным материалом цри химическом синтезе некоторых цефалоспоринов — антибиотиков, обладающих незначительным побочным эффектом н активных в отношении множества бактерий, — является 7-амипоцефалоспорановая кислота (7ЛСА), которая в свою очередь синтезируется нз антибиотика цефалгкггорнгга С (рнс.
12.11). К сожалению, природных микроорганизмов, способных синтезировать 7АСА, ло снх нор не выявлено. Новый путь бносинтеза 7АСА был сконструирован включением специфических генов в цлазмнлу гриба Асгетагггит с)пуза!!спит, который обычно синтеризует толь- дпя нанравлсиного изменения нрокариот, синтезирующих определенные мезаболиты, в приннинс есть два пути. Во-первых, можно изменить активность или содержание олного или нескольких Ферментов того или иного биосинтстичсского пути с тем, чтобы увеличить нролукнию нужного мстаболига. Во-вторых, в нрокариотичсский геном можно ввести чужеролныс гены, копирующие Ферменты, которые„используя энлогенный мстаболит в качестве субстрата„ обеспечат си~ггсз мстаболита, изначально нс пролуцирусмо| о хозяйской клеткой.
Тако~о рола манипуляции представляются достаточно врос~мни, однако далеко не всегда ким образом, прежде чем илс|~тиФинироваты ен, нужно было очистить соответствующий белок и частично секвенировать его, а затем на основании данных об аминокислотнои нослсловательности сконструирова гь зонлы для щбрилизании.
Это была одна из первых работ, относящихся к той области исследований, козорую иногла наэываютинжснериеймсзаболизма. Втакого рода работах из олгго~о микроорганизма в другой псреносяг гены, гпвгжсгвенныо за какуюто часть мстабол ичсског о пути, так что второй микроорганизм приобретает способность сигггезировать новые мстаболиты. 2бб ГЛАВА ! 2 всрвв С Оксилазт О-аиввоквсчот с-Мйу 4. Й В О1:7АСА Цс ссср 7АСА Биополимеры Биополимеры — это высокомолекулярные соединения, синтезируемые живыми организмами.
Некоторые из них обладают ценными физическими и химическими свойствами и могут использоваться в пищевой, перерабатывающей н фармацевтической промышленности. С возникновением технологии рекомбинаптных ДНК появилась возможность создавать новые биополимеры„заменять синтетические продукты нх биологическими аналогами, модифицировать уже существующие биополимеры с целью улучшения их физических и структурных характеристик, повышать эффективность соответствующих промышленных процессов, уменьшать их стоимость. Создание реколбинангпнои бактерии Хоп!)чопчопав сагпрех!т с целью получения ксанжановой слизи ХапЯотопаз си 7прсггт — грамотрицательпая облитатно аэробпая почвенная бактерия, синтезирующая ценный коммерческий бнополимер ксаьпановую слизь, высокомолекулярный экзополисахарчид.
Его структурный каркас составляет линейная полимерная цепь из молекул глюкозы. К каждому второму глюкозному остатку присоединена трисахаридная боковая цепь, состоящая из однго остатка глюкуроповой кислоты н двух остатков маннозы (рис. 12.18). Ксантаповая Рис. 12Л7. Генетически сконструированный пуп, биосинтсза 7-амяноцефалоспорановой кислоты (7АСА) из цефалоспорина С.
Ген оксилазы О-аминокислот выделен из гриба Р. зс!ае', а ген цсфалсспоринацилазы — из бактерии Р. свив(пи!а. слизь имеет высокую вггзкость, пе разрушается в агрессивных физических и химических средах и по физическим и химическим свойствам напоминает пластик. В частности, ее можно использовать как стабилизирующий, эмулыируюший, загущающий или суспендируюший а~сит. Для успешного коммерческого производства ксаптановой слизи необходимо выращивать Х. сап!раппу на недорогом и доступном источнике углерода. Х.
сагпрсггг!з дикого типа эффективно утилизирует глюкозу, сахарозу и крахмал, но пе лактозу. При производстве сыра в большом количестве образуется такой побочный продукт, как сыворотка. Она состоит из воды (94 — 95%), лактозы (3,5 — 4%) и небольших количеств белка, минеральных веществ и низкомолекулярпых органических соединений. Огромные количества сыворотки Лает молочная промышленность, и ее утилизация — это большая проблема. Часто сыворотку сливают в реки и озера, что приводит к уменьшению в них количества доступного кислорода и гибели многих водных организмов.
Транспортировка сыворотки к местам захоронения мусора обходится очень дорого, к тому же серьезную проблему создает риск загрязнения ею грунтовых вод. Наконец, большие средства уходят на удаление твердых компонентов сыворотки. Все это застави чо попытаться найти способы выюдной переработки сыворотки. Сыворотку можно использовать как источник углерода при выращивании ценных промьцплен- Использование рекомби нану ных микроорганизмов для получения коммерческих продуктов 267 сн,он сн,он Рис. 12.18.
Структурная формула полисахарида, образукицего ксаптапоиую слизь. Каркас составляет линейная полимерная цепь из молекул глюкозы. К каждому второму остатку присоединена трисахаридная боковая цепь. Дикий тип 3530 245 224 трвнсбгормвнт 37!! 3600 424! Выделение генов биосинтеза лгеланина ных микроорганизмов.
Чтобы Х сатрезгггл приобрела способность расти на сыворотке, было проделано слсдуюшее. Гены !асс )' Е сой, кодируюшис ферменты 1)-гшгактозидазу и лактозопермеазу, встроили в плазмиду с широким кругом хозяев так, чтобы они находились пол транскрипциопным контролем промотора одного из бактериофагов Х сатреийз. Зту конструкцию ввели в Е. сай, а затем перенесли из Е. сой в Х. сатрелн й тройным скрещиванием. Трансформанты, сопержащис плазмиду, сипзсзировали 15- гадактозидазу и лактозопермеазу, используя лактозу как единственный источник углерода, а также продуцировали в больших количествах ксантаиовую слизь, используя в качестве источников углерода глюкозу, лактозу и сь!воротку (табл.
12.4). Подчеркнем сше раз, по Х сагггрезуггз дикого типа синтезирует много ксантановой слизи, только когда растет на глюкозе. Мсланипы образуют многочисленное семейство различных поглощающих свет биополимеров; их синтеризуют животные, растения, бактерии и грибь!. Этти пигменты можно было бы использо- вать при изготовлении солпцезашитных экранов и покрытий, в качестве добавки к кослгетическим средствам. В настоящее время мсланины получают в небольших количествах либо экстракцисй из природных источников, либо путем химического синтеза. С помошыо технологии рекомбинантных ДНК, возможно, удастся созда'и недорогое крупномасштабное производство меланинов с различными физическими свойствами. Таблица 22 4.
Синтез ксантанояой слизи и трансфор- мированных клетках Х саигрезгпл и клетках дикого типа, растущих н среде с разными источниками угдеродап Х геюрезр З Количество ксвигаиовой слизи, мкг/млзг 0,4% глюкозв 0,4% викт!ив !0% сыворотки '! По лонным рабаты Ви звени Ллрб Евиюв.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
