Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 74
Текст из файла (страница 74)
Подавляюгпее большинство основных антибиотиков было выделено из грамположителыкзй почвенной бактерии оггергогпусез, хотя их продуцируют также грибы и другие грамположительные и грамотрнцательные бактерии. Ежегодно во всем мире производится 100 000 т антибиотиков па сумму 25В ГЛАВА 12 примерно 5 млрд. лолларов, в том числе более 100 мли. долларов прихолится на долю антибиотиков, добавляемых в корм скоту в качестве добавок или ускорителей роста.
По оценкам, каждый год ученые обнаруживают от 100 до 200 новых антибиотиков, прежде всего в рамках обширных исследовательских программ по поиску орели тысяч различных микроорганизмов таких, которые синтезировали бы уникальные антибиотики. Получение и клинические испытания новых препаратов обходятся очень дорого, и в продажу поступают только те из них, которые имеют большую терапевтическую ценность и представляют экономический интерес. На их долю приходится 1 — 2% всех обнаруживаемых антибиотиков. Большой эффект злесь может лять технология рекомбинантных ДНК.
Во-первых, с ее помощью можно создавать новые антибиотики с уникальной структурой, оказывающие более мощное воздействие на определенные микроорганизмы и обладающие минимальными побочными эффектамн. Во-вторых, геиноинжеиерные подходы могут использоваться для увеличения выхода антибиотиков и соответственно для снижения стоимости их производства. При создании рекомбииантных штаммов оугеруотусау — основного микроорганизма, используемого для получения аитибиотиков,— важно помнить, что трансформация и отбор трансформированных клеток не должны быть слишком сложными. Олнако в отличие от Е. соб оугеруотусеа существуют не в виде изолированных клеток, а в виде протяженных мицелл.
поэтому перел трансформацией необходимо разрушить клеточную стенку и высвободить отдельные протопласты (рис. ! 2.9». Без этого будет невозможно отличить трансформированные клетки от иетраисформнрованиых, поскольку видимые колонии на твердой среде будут образовываться из группы клеток, а не из индивидуальной клетки; соответственно колонии, растущие в присугствии селективиого антибиотика, будут представлять собой смесь трансформированных и не- трансформированных клеток. Проникновение плазмидной ДНК в прогопласты огтдготусеа облегчается в присутствии иолиэтилеигликоля. После трансформации протопласты сначала высевают иа твердую среду, чтобы образовалась ы Фар р ру клеточной стснкя О ,, ОООЯО С» О(ч» О .
Прстспласты О ®О 'О О ОО СОО О О | Дсбаалсннс Д НК я пэг О Трансформнрояаяныс „, О((»»О клетки — О ОО ., ' О Нетрансфор- О ' Оя мнроаанныс ' С|15 клетки | Выссааннс на среду $ лля регенерация ыс клетки Отделан Чашка Петри Пересев на сслсхтнаную среду Колонна, выросшая из отдельной клетки Рнс. 12.9. Схема трансформации н отбора рскомбннантных гнтаммов 5ггерготуст. Трансформированные клетки обозначены розовыми кружками, негрансформнрованныс — зелеными. ПЭà — полнзтю~снглнколь.
клеточная стенка, а затем для отбора трансфор- мированных клеток переносят на селективную среду, обычно содержащую либо и сом ици ~ и либо тиострептон. Использование рекомбинантных микроорганязмов для получения коммерческих продуктов 259 Клонирование генов биосинтеза антибиотиков (СН,),,ЕН, Н Синтез новых антибиотиков о Процесс биосинтеза одного антибиотика может состоять из 10 — 30 ферл~ентативных реакций', так что клонирование всех генов его биосинтеза— задача не из легких.
Один из подходов к выделению полного набора таких генов основан на трансформации одного или нескольких мутантных штаммов, не способных синтезировать да иный антибиотик, банком клонов, созданным из хромосолшой ДНК штамма дикого типа. После введения банка клонов в мутантные клетки проводят отбор трансформантов, способных синтезировать антибиотик. Затем выделяют плазмидную ДНК клона, содержащего функциональный экспрессирующийся ген антибиотика (т. е. ген, восстанавливающий (комплементирующий) утраченную мутантным штаммом функцию), и использукп ее в качестве зонда для скринннга другого банка клонов хромосомной ДНК штамма дикого типа, из когорого отбирают клоны, содержащие пуклеотидные последовательности, которые перекрываются с последовательносп ю зонда.
Таким образом идентифицируют, а затем клонируюг элементы ДНК, примыкающие к комплементирующей последовательности, и воссоздают полный кластер генов биосинтеза антибиотика. Описанная процедура относится к случаю, когда зти гены сгруппированы в одном сайте хромосом> юй ДНК. Если же гены биосинтеза разбросаны в виде небольших кластеров по разным сайтам, то нужно иметь по крайней мере по одному мутанту па кластер, чтобы получить клоны ДНК„с помощью которых можно идентифицировать остальные гены кластеров. Этот подход с успехом использовался для идентификации некоторых генов биосиптеза ундецилпродигиозина нз 5)гер!отусез соебсо(ог А3 (рис. 12.10).
В этом случае комплементационный анализ основывается на сравнении цвет» колоний: колонии микроорганизмов дикого типа имеют красный цвет, а колонии мутантных микроорганизмов — кремовый. Таким образом, в результате комплементации образуется красная колония. Помимо комплементации, для идентификации генов биосннтеза антибиотиков могут использоваться и болсе прямые подходы. Так, с Рис. 12.10.
С шукзурпая формула у>иешппролш иозипа. помощью генетических или биохимических экспериментов можно идептифицироватгп а затем выделить оЛин или несколько ключевых ферментов биосинтеза, определить их )х'-концевые амипокислотные последовательности и. исходя из этих данных, синтезировать олигонуклеотидные зонды. Этот подход использовался для выделения из РениуИ!ит сягуводенит гена сиптетазы изопенициллипа )ч.
Этот фермент катализирует окислительную конденсацию 6-(1 -а-аминоадипил)-Е-цистеиннл-О-валина в изопенициллип (ч, ключевое промежуточное звено в биосинтезе пенициллинов, цефалоспоринов и цефамицинов (рис. 12.11). Новые антибиотики с уникальными свойствами и специфичностью можно получить, проводя генноинженерныс манипуляции с генами, участвующими в биосинтезе уже известных антибиотиков. Один из первых экспериментов, в ходе которопз был получен новый антибиотик, состоял в объединении в одном микроорганизме двух немного различающихся путей биосинтеза антибиотика.
Одна из плазмид Ягерготусех, р132303, несущая фрагмент хромосомной ДНК Л. еоейсо)о длиной 32,5 т.п.н., содержит все гены фермегггов, ответственных за биосинтез из ацетата антибиотика актинородина, представителя семейства изохроманхиноновых антибиотиков (рис. 12.12). Целую плазмиду и различные субклоны„несущие части 32,5 т.п.п.-фрагмента (например, р132315) „вводили либо в штамм АМ -7161 ЯгерГотусев зр., синтезиурующий родственный антибиотик медермицин, либо в штамм В1140 или Т022 Х ло1асеогиЬег, синтезирующие родственные антибиотики гранатицин и дигидрогранатицин. Все указанные антибиотики являются кислотно-щелочными индикаторами, которые прн- 260 ГЛАВА(2 | Свите»в»в нзппвннннпвннв К Нзы Н 5 СН, сн — (снй,— сом -с НООС СН.
Изп»»спнцнллнн Н Пвнн»»»»л»пп~ О Пеннннппнн М дев~ ~в»онс»»»зефвлпс»»орнн С Л«внвзнвнвфвзвспорнн С !(сфвппспорнн С !.-ц-вннновлннннпввв кисло»в + Г-»~и»зсн»~ в ! -ввзнн Нзы Н сн, СН вЂ” (СН,)з — СОН НООС сн, О Н СООН Лают растущей культуре характсрный цвет, зависящий от рН среды (табл. !2.3). В свою очсрсдь рН (и цвст) среды зависят от топп какое соединенис синтезируется. Му»анты родительского штамма Х соебсо)о»; нс способные синтсзировать актиноролип, бесцвстныс.
Появлсннс окраски после трансформации пггамма ЛМ-7161 Х)гергол»усев з!з. либо штаммов В!!40 илн Тц22 Х. »)о)асеогиЬег плазмидой, нссушсй все илн несколько генов, кодируюших фсрменты биосннтсза актинородина, свидетсльствуст о синтсзс нового антибиотика (рис. !2.12, табл. 12.3). Трансформанты пгтаммс АМ-7161 Хгге)»гопгусгз зр. и штамма В!140 Х н)о)агеогиЬв»; содержащие плазмилу р112303, синтезируют антибиотики, колируемыс и плазмнлой, н хромосомной ДНК. Однако при трансформацизи штамма Т022 Х в)оРасеап»Ьег пиазмилой рЦ2303 зшряду с актинородином синтезирустся новый антибиотик— дш.илро».ранатироднн, а при зрансформапни Рне. 12.11. Биосинтез пенициллинов н цефвлоснорннов в Р.
с)»гузоягпилп Синтствзв изопснициллннв (Ч квтализирует синтез из б-(1-а-вминоалипи»»)-1 -цнстс»»нил-1»-ввл»»пв нзопсняциллинв )Ч— нрсдшествеиннкв пенициллина С», пенициллина(Ч и цефвлос»юрина С. штамма АМ-716! Х)герта»з»исез зр. плазмидой р(32315 синтезируется еще один новый антибиотик — мсдерродип А. В структурном отношении эти новые антибиотики мало отличаются от актинородина, медермицина, гранатицина и гидрогранатицина и, вероятно, образуются в том случае, когда промежуточный продукт одного пути биосинтсза служит субстратом для фермента друпл о пути. Котла будут детально изучены биохимичсскис свойства различных путсй биосинтеза антибиотиков, появится возможпос»ь создавать новые уникальные высокоспе» !ифичныс антибиотзики, манипулируя генами, которыс кодируют соответствующие фсрмснты.
Разработка новых методов получения поликетидных антибиотиков Термин «поликстидные» относится к классу антибиотиков, которые образуются в результате Использование рскомбинантных микроореанизмов для полу !синя комл1ерчсских пропукюп 20! Хаблана !23. Анпибиотики, синтсзирусмыс различными шпаммами 5атр!ащусеж н том числе штаммал1и, трансформированными плазмипами р132303 и р!323! 50 Антибиотик!и! 11!тким/пддзмнда Цвет культуры щелочная среда Синий Кори пщкый Синий озиолстоиый Сипи-фиолетовый кислан среда Красный Жсптыя Крксньщ Х еоедео!ог Ак~инаралпп Мсдсрмипнп Мелерм шпик кк~ ипоро!оп~ Мспсрропн~ ~ А. мспсрм нонн Грпнпти~ппь 1пн нлрогранк4ипнн Г ране папин. лш илрогркнптипно, пш нпопол по Гам ы пшнп, пнгнпро~ рпнитипип 1!пгилрогреещшроп1ш, ичнноролпп 5!ор!итуеек ьр. Х!юр!еп~усез ер./р!32303 .В!ер!омусез ер./р1!23 ! 5 Д ое!исомиаегв1140 Х но!иееогиЬег В ! 140/р П2303 Х по!псеогиЬег!"п22 Х е!Маге!ет~бегт 622/Р1.12303 '1 Пидепеие~ раьоеы Нор«сое и л1., йил~ге314: 642 644, 1985 последовательной ферментативной конденсации карбоновых кислот типа ацстата, пропионата и бутирата.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
