Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 75
Текст из файла (страница 75)
Некоторые гюликетидпые антибиотики синтезируются растениями и грибами, но больная их часть образуется актиномицетами в ниде вторичных метаболитов. Прежде чем проводить манипуляции с генами, кодирующими ферменты биосинтеза поликетидных антибиотиков, необходимо выяснить механизм действия этих ферментов. Поликетидныс антибиотики сиптез14руются по тому же пути„что и длинноцепочечные жирныс кислоты. В результате каждою цикла конденсации к растущей углеродной цепи добавляется 15-кетогруппа.
Процесс состоит из рида повторяющихся стадий, вкцочающих восстановление кетогруппы, дегидратацию и восстановление р-еноильных групп в растущей поликети/0!ой цепи. Существуют два класса поликетидсиптаз — фермсптных комплексов, ответственных за синтез поликетидпых антибиотиков (рис. 12.13). Первый класс составляют синтазы, катализирующие реакции биосинтеза ароматических поликетидов; каждая синтаза представляет собой один полипептид с одним активным центром, который последовательно катализирует биосиптетические реакции (рис. 12.13, А). Второй класс включает синтазы, образованные несколькими полипептидами (А — Е на рис. 12.13, Б); каждый из них имеет свой активный центр и обладает специфической фермептативпой активностью, катализирующей определенную реакцию биосинтеза.
Если каждый домен субъединицы многофункциональной поликетидсин.газы, обладающий ферментативной активностью, кГпализи. рует определенную реакцию, го утрата любой из активностсй затронет только одну реакпию биосинтсза, а изменение домена с известной функцией приведет к предсказуемым пзл1снениям структуры синтсзирусмою антибиотика. Твк, де сально изучив Генети 1ескис и биохимические составляющие биосинтсза эритроми11ина в клетках Засгнагара1ук!!ага егуг/!гаса, удалось внссм1 специфические изменения в гены, ассоциированные с биосннтсзом этого антибиотика, и синтезировать производныс эритромипина с другнмн свойствами.
Вначале была определена первичная структура фрагмента ДНК Х агу!/!гаса длиной 56 т. и. н.. содержащего кластер генов е!у, зачем двумя разными способами модифицирована .зритромипинполикстидсннтаза. Для этол) 1) удаляли участок ДН К, кодирующий р-ксгорсдуктазу, либо 2) вносили изменение в участок ДНК, колирующий еноилрсдуктазу. Деления 15-кстореду1стазного гена приводила к накоплению промежуточного пролукта, у которого к С-5-атому колыщ была присоединена карбонильная 1руппа, а не гилроксильная (рис.
12.14), а мутация в гене еноилредуктазы — к образованию двоинои связи между атомами С-б и С-7 (рис. 12.14). Из этих экспериментов слелует, что если иде1 1тифнцировать и охарактер1лзовать кластер генов, колируюп1их ферменты биосинтеза определенного поликстидного антибиотика, 1о, внося в 262 ГЛАВА 12 НО СОО О Медермиинн Актинореднн ОН ОН О Ме ОН ОН О Ме О Н ОН О Гранатидин Дшидрограаа1идин ~ ~(Ме12 ОН ОН О Ме СООН Н ОН О Медерродин А Днгидрограиатиродин Рис.
12.12. Структурные формулы различных изохроманхиноновых антибиотиков, синтезнруемых гдтаммами 5ггердддуеек Х еоейсо!великого типа и плазмида рц 230 3 кодируют актинородин; 5ггерготусез зр. синтезирует ме- дермипнн. а 5'. ио1асеогиеег — грана пщин и лигидрогранатинин. Си~ггезируемые гибридные антибиотики — зто мелерродин А и лигилрогранатиролин. них специфические изменения, можно будет направленно изменять структуру антибиотика. Кроме того, вырезая и соединяя те или иные участки ДНК, можно перемегцать домены поликетилсинтазы и получать новые поликетидные антибиотики. Все кластеры генов ароматических поликетилов содержат три гена, колирующих так называ- емую минимальную поликетидсинтазу. Этот ферментный комплекс включает кетосинтазу (с ацилтрансферазпым Ломепом1, фактор, определяющий ллипу цепи, и ацнлпереносящий белок.
Минимальная поликетилсинтаза отвечает за синтез ароматического поликетидпого остова, а его модификации осуществляются другими ферментами, действующими согласо- Исполсаование рекомбинантных микроорганизмов лля получения коммерческих пролуктов 263 Усовершенствование производства антибиотиков аа Реп хлв А ! т.п.н. ! ! Кстосннтазл П Ацнхнср«носящая белок П!й Фахгор, опрелеляющнй длину цепи (75~ Ацнлтжьнсфераза Д Ксторедуктаза й11! Аролсатаза И Цнххьза Щ Аромат«за/цнклаза 1 ) О-мстилтрансфераза Нов он но О О 1'яс. !2АЗ. Схематическое изображение структуры поликетлцссннтазы ароматических поликстилов, у которой активный центр находится в одном полинеппсце (А), и поликепглсннзвзьц представляющей собой комплекс нескольких полипеп силов с разными активными центрамн (Б). Ферменты обоих типов солержат несколько доменов (А — Е), каждый из которых обладает собственной фермснтатнвной активностью.
пасто с ней. Гены, кодирующие все эти ферменты, обычно организованы в один кластер (рис. 12.15). Каждый кластер генов кодирует синтез определенного антибиотика. С помощью обмена генами между кластерами были синтезировапы лва новых ароматических поликетидных антибиотика (рис. 12.1б), что еще Ряс. 12.14. Пронзводныс зригромицнна, полученные генноинженерцымн лктоламя.
А. В результате мутация в ганс снонлрелутазы образуется пролукт с двойной связью между атомами С-6 н С-7 (цветной кружок). Б. Дслецяя гена ))-кеторслуктазы сопровождается образованием производного с С-5-карбонильной, а не гилроксилыюй группой (пветной кружок). (По данным работы Кцсх, 0опзс1)о, Алпщ Рек МсснлЬий. 47: 875 — 912, 1993.) раз иллюстрирует возможности генной инже- нерии. С помснцью генной инженерии можно не только создавать новые антибиотики, по и увеличивать эффективность синтеза уже известных.
Лимитирующим фактором в промышленном производстве антибиотиков с помощью 5)гер/отусех врр. часто является количество доступного клеткам кислорода. Вследствие плохой растворимости кислорода в воде и высокой плотности культуры Югер/отусег его часто оказывается недостаточно, рост клеток замедляется и выход антибиотика снижается. Чтобы решить эту проблему, можно, во-первых, изменить конструкцию биореакторов, в которых выращивается культура Блерготусегн а во-вторых, используя методы генной инженерии, создать штаммы Бггер!отусега более эффективно использующие имеющийся кислород. Эти два подхода не исключают друг друга. Рве. !2.15.
Кластер генов бносннтеза ароматических полнкетилных антибиотиков алтинороднна (асс), тстраценомнпина (Гст), фрснолицина (/геп) н грнзеузина (хпв). Каждый кластср содержит гены, Коднрующие минимальную поликетилсинтазу, которая отвечает за синтез полнкстидного остова.
Ферменты, коднрусмые лругими гснамн, катализируют реакции его модификации. Сужающийся «конец» гена указывает направление его транскрипции. 264 ГЛАВА 12 О О 5 наес а а 5 !5!ОС !%5 5 ! ни 555 О О а О О5 56 а а а а ! 5-5 а а а а О 5В а а а а а а а а а !! О а а а НО 5 7 на 5 н 555 Он а О О ~Сб х. 55! С УС Й ~:6.. ан Одна из стратегий, используемых некоторыми аэроб55ыми микроорганизмами для выживания в условиях педостаткакнслорода, состоит в синтезе гемоглобипподобного продукта, способною аккумулировать кислород и доставлять его в клетки. Например, аэробная бактерия Й/ еохс///а зр.
синтезирует юмодимерныи гемсолержащий белок, функционально подобный эукарнотическому гемоглобину. Ген чемоглобина5 Г/Ггеоге///а был выделен, встроен в плазмидный вектор О/гер/оглусел и введен в клетки этого микроорганизма. После его экспрессии на долю гемоглобина 1'5/геозет//а приходилось примерно 0,1% всех клеточных белков Х сое//со/ог даже в том случае, когда экспрессия осуществлялась под контролем собственного промотора гена гемоглобина Р/Гп5олс///а, а не промотора Катр/он!усек Трансформированные клетки Х сое//со/ог, растущие 5 ! 555 ан а а а а а а О 5-5 Рие. 12.16.
Искусственна созданные пути биаснптеза паликетидных антибиотиков КЕКЛЗ н КР5К26. Обазначенигс ис/ — актннараднн, Гсл5— тет~мце55ами55ин, /гвл — френалнцин, кпл— 5ризеузин, пцп РКΠ— минимальная пыикетидсинтаза, Кй — б-кетаредуктаза, АИО— араматаза, СУС вЂ” циклаза. Использование рскомбинантных микроорганизмов лля получения коммерческих пролуктов 2б5 Получение 2-кето-Е-гулоната — промежуточного продукта синтеза 1 -аскорбиновой кислоты — с 1!омон(ыо рекомбинантной бактерии Еггггнга ЬегЬгсо1а 5. Апг)сгзоп, С.
В. Маг!гз, й. Вааагиз, й Мй!сг, К. Майой, 3. Всгутоог, (з. !забг, Ъ'. Ваменсг, )у. Емец .Уоепсе 2305 !44 — !49, ! 935 уластся выделить нужный геи и подобрать подходящие условия лля его экспрессии. Чтобы создать бактерию, синтезирующую 2-кето-!.-гулоновую кислоту, непосредственною предшественника витамина С в промышленном нроизволстве этого витамина, Лнлсрсон и лр. вьщслили из СогупейасГепнт ген Фермента, катализирующсго орсвращснис 2,5-ггикето-!Э-гэ1гоконовой кислоты в 2-кето-1..-гулоновую кислогу, и ввели щот ген в клетки Вгтпза зр. — бактерии, синтезирующей 2,5-ликсто-0- ~люконоаую кислоту из Выгпюкозы. Выделение этого гена осложнялось тем, что сам Фермеггг практически нс был изучен.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
