Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 72
Текст из файла (страница 72)
Нуклеотидные последовательности, расположенные до стартового колона АТО, вырезали и заменяли их сигналами транскрипции и трансляции, функционирующими в Е. со»», поскольку регуляторные последовательности грамположительных микроорганизмов типа Со»упебасгепит зрр. не функционируют н клетках этого микроорганизма.
Полученную конструкцию вводили в Исполыояание рекомбинантных микроорганизмов для получения коммерческих продуктов 2Я СНяОН ! но — с — н Кязю~итяческое воссгвновление ! н — с — он н, но — с — н ! сно СНзон сн,он ! ! но — с — н С ==О Химическое НО С Н Сорбигсяшегиярогенвзя НО С Н окисление ! — вь. Н вЂ” С вЂ” ОН Н вЂ” С вЂ” ОН НЛО НЛОН ! но — с — н но — с — н ! ! сн,он сн,он Ьь сорбизол !.-сорбозв зО ГЗн люкозя О=С с — оя О с — оя ! СООНа ! С вЂ” Она !! С вЂ” Она ! — С вЂ” Он ! — С вЂ” Н ! СООН ! С=О ! НΠ— С вЂ” Н ! Н вЂ” С вЂ” ОН ! НΠ— С вЂ” Н ! сн он Обрябогкя кисло!ой НΠ— С вЂ” Н ! сн он !.-яскорбииогюя кислота СН,ОН 2-К! О, нвзриеввя соль !епольивя Форма) 2-Кьсс Рис, 12.2.
Промышленный синтез 1 -аскорбиновой кислоты. Олна из с!алий процесса, в именно превращение 0-сюрбитала в 1-сорбазу, осуществляется при участии бактерии АсегоЬисгег заЬохуггипз, которая синтезирует фермент сорбиталлегилрогеназу. Остальные стадии представляют собой чисто химические реакции. Е. сийг (при этом синтезировалась активная 2,5- ПКСз-редуктаза), а затем переклонировали в векторе с широким кругам хозяев и трансформировали им а)зггпга ЬегЬгса!а. Трансформированные клетки Егзягпга активно превращали 0-глюкозу непосредственно в 2- К).О, при этом собственные ферменты Ьггегпга, локшгизованные во внутренней мембране баггериальной клетки, преобразовывали глюкозу в 2,5-12КО„а 2,5-0КСз-редукгаза, локализованная в цитоплазме, катализировала превращение 2,5-ВКСг в 2-К1.Сз (рис.
! 2.4). Таким образом, с помощью генетических манипуляций метаболические реакции, протекающие в столь разных микроорганизмах, удалось осуществить в одном из них. Этот гибрид приобрел способность синтезировать конечный продукт комбинированного метаболическога пути. Такой организм можно использовать как фабрику лля производства 2-К(.сз, заменяющую первые три стадии в том процессе получения (.-аскорбиновой кис- лоты, который используется в настоящее время (рис. 12.2). Коммерческую ценность 2,5-ОКСг-редукгазы можно повысить, если произвести аминокислотные замены, повышающие каталитическую активность фермента и его термостабильность.
В то время, когда был идентифицирован ген 2,5-ОКО- редуктазы, аминокислотные остатки, участвующие в образовании активного центра этого фермента, егце не были установлены. Однако„исходя из данных об аминокислотной последовательности фермента, была гюссоздана его вторичная структура, состоящая из восьми тесно расположенных параллельных !з-слоев, перемежающихся восемью п-спиралями„которые соединялись с !)- слоями петлями разной длины (рис. 12.5). Такай характер укладки полипептилной цепи был установлен для 17 других ферментов с уже известной кристаллической структурой, и по аналогии с ними были идентифицированы три петли, возможно участвующие в связывании субстрата. С помо- 252 ГЛАВА 12 Ееъемее Оетяебаеееляят 2,5-ОКО Нрсяряшсние, асуи~есеняяелюе рекомбияагаяым НО мллкроовлянизл~ол~ -- — ---- — — чл Н— НО— 2-К1.О Ряс.
12.3. Микробиологический синтез 2-КГО. Еезегп/а продуцирует три фермента, обеспечивающих синтез 2,5-ГЗКО из О-глюкозы, а СапуяеьасГеоит — фермент, кзгализируюший превращение 2,5-ОКО а 2-К1.С'. Таким образом, 2-КГО, непосредственный предшественник 1=аскорбиновой кислоты, можно синтезировать из О-глюкозы совместным кульгивированисм згих двух микроорганизмов.
Алгпернативный подход сосюит я создании рекомбинантной бактерии Ееъеиа, зкспрессируюшей ген соответствующего фермента Светая ьасгепат. Шью олигонуклеотид-направленного мутагенеза были получены 12 мутантных белков, каждый из которых содержал одну аминокислотную замену в одной из петель. ! 1 мутантных форм 2,5-ПКС- редуктазы обладали более низкой удельной активностью, чем нативный фермент, а 12-я, у которой остаток глутамина в положении 192 был заменен на аргинин, была примерно в два раза более активной. По данным кинетических исследований, повышение активности было связано с увеличением в 1,3 раз максимальной скорости (Ря„„) и уменьшением на 25% константы Михаэлиса (7л ) реакции, катализируемой ферментом.
Замена глициновых остатков в положе- СНО Н вЂ” С вЂ” ОН ! НΠ— С вЂ” Н ! Н вЂ” С вЂ” ОН 1 Н вЂ” С вЂ” ОН ! СН,ОН Ы-глюкоза СООН С=О ! НΠ— С вЂ” Н ! Н вЂ” С вЂ” ОН 1 С=О ! СН,ОН СООН ! С=О 1 С вЂ” Н С вЂ” ОН С вЂ” Н сн он ниях 55 и 57 на аланиновые позволила получить более термостабильный фермент по сравнению с нативной формой. Дальнейшие усилия будут, вероятно, направлены на получение фермента, сочетающего оба этих свойства. Синлзез индиго Множество бактерий, особенно бактерии вида Раеш/отопаз, способны утилизировать различные ор~ анические соединения типа нафталина, толуола, ксилола и фенола, которые являются для них единственным источником углерода.
Очень часто гены ферментов, катализирующих расщепление этих органических соединений, располагаются в крупных природных плазмидах (длиной 50 — 200 т.п.н.). Чтобы ставить эксперименты с этими бактериями, в частности проводить целенаправленную модификацию генов ферментов, катализирующих те или иные метаболические реакции, приходится предпринимать детальные генетические и биохимические исследования, и нередко в ходе этих исследований делаются неожиданные и весьма интересные открытия.
Рассмотрим следующий пример. Плазмида НАН7 содержит два разных оперона, которые позволяют несущим ее псевдомонадам использовать нафталин как единственный источник углерода. Для характеристики соответствующих генов расщепили плазмидную ДН К с помощью ге7пл)Ш и лигировали фрагменты с линеаризованной Иле)П( плазмидой рВ)(322. Полученные гибридные молекулы ввели в клетки Е. сои и отобрали трансформантов, устойчивых к ампициллину, но чувствительных к тетрациклину. Затем проверили всех трансформантов на способность образовывать нелетучие метаболиты — возможные продукты гидролиза радиоактивно меченного нафтатина. При исследовании одного из трансформантов, содержащего вставку длиной 10,5 з.п.н. и способного превращать нафталин в салициловую кислоту, обнаружилось, что минимальная ростовая среда, содержащая триптофан, приобретает синюю окраску.
Тщательный анализ этого явления показал, что трансформированные клетки Е. сой синтезировали краситель инлиго. Синтез происходил в четыре стадии (рис. 12.6). Использование рскомбинантных микроорганизмов для получению коммерческих продуктов 253 В-п|юк !Э-|люкс кислом 2-кето- новая к 2,5-1ЭК 2,5-РКС Рис. 12.4. Превращение Р|люкозы в 2-КРР рекомбинантцой бактерией ХУэс!л!а Асс!исо!а. Все учасгвующие в этом процессе ферменты обозначены буквой Е и последовательно пронумерованы, указана также их клеточная локализация. 2-Коз Цитовлатм ллязмати остраве Субстра|связывающие петли Рис.
12.5. Структура 2,5-РКС'-редуктазы, воссозданная исходя из ее аминокислотной послелояательности. Стрелки — !5-слои, полоски— ц-спиральные участки, кружки аминокислотцыс остатки, нахолящиеса на 1ч- и С-концах молекулы или соединяющие б-слои и а-сцир|ыи. Показаны три петли, возможно, участвующие в связывании субе|рата. Желтый кружок — 192-и аминокислотный остаток. С-кспсп М-колец 254 ГЛАВА 12 !. Превращение триптофана в индол с помоп1ью триптофаназы, которая синтезируется в хозяйских клетках Е. со1Е 2.
Окисление индола до цис-ивдол-2,3-дигидролиола пол действием нафтшчин-диоксигеназы, которая кодируется ДНК, переклонированной из плазмиды 1к1АН7. 3. Спонтанная дегидратация. 4. Окисление на воздухе с образованием индиго. впервые выделен из растении; сейчас его получают путем химического синтеза. По оценкам, в год производится примерно 1,5 ! 0" кг этого красителя на сумму около 200 млн. долл. Индиго окрашивают джинсовую ткань, и объем его продаж больше, чем любого другого красителя. Возможность получения индиго с помощью микроорганизмов позволяет разработать весьма эффективный и экономичный крупномасштабный микробиологический способ его производства, что дает возможность обойтись без использования таких токсичных вегцеств, как анилин, формальдегид и цианид, которые необхолимы при химическом синтезе индиго.
В настоя!нее время биотехнологи пытакпся подобрать оптимальные условия вырап1ивания больших количеств штамма Е. со!1, способного к синтезу индиго. Среди подбираемых параметров температура, рН и количество триптофана в среде„обеспечивающее максимальный выход Таким образом, комбинация ферментов лвух разных метаболических путей двух разных организмов привела к неожиданному синтезу красителя индиго. Введение в Е со!1 гена ксилолоксидазы, содержащегося в плазмиде ТО!., может обеспечить превращение триптофана в инлоксил, спонтанно окисляюШийся до индиго (рис. 12.б). Индиго, синий пигмент, который применяется для окрашивания хлопка и шерсти, был ! ~ 1И 1ч Ов РИ Иилоксил Слоиглияля легидрлзаяия яис-цижю-2,3- дя гялродиал Индиго Рис.
12.6. Биосинтез инлиго из триптофана, осушествляемый генетически модифицированной Е со!г. Тригпофаназа — один из ферментов, иролуцируемых Е. соре Ген нафталиндиоксигеназы, каттюизируюшей реакцик> А, происхолит из плазмиды 14АН, а геи ксилолоксидазы, клтвлизируюшей реакцию Б, — из цлазмиды ТОК В трансформированных клетках Е. сов индиго синтезируется либо до цуги А, либо по пути Б, ио не оо ним обоим одновременно. Использование рекомбвнантных микроорганизмов для получения коммерческих продуктов 255 Субстраз Г! редукт Ряс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
