Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 85
Текст из файла (страница 85)
Выделение прокариоогических иегигюлазных генов Многие бактерии и грибы способны расщеплять целлюлозу благодаря совместному действию нескольких ферментов, называемых целлюлазами. Н Н Рис. 13.14. Сегмегп полимерной цепи цсллголозы. Остатки глюкозы соединены !)-1,4-связямн молода к хвосту». бом случае необходимые для этого энергетические затраты существенно повысят стоимость конечного продукта. Головое производство лигноцеллюлозы огромно, поэтому ведется непрерывный поиск более зффективных способов фсрментативного расщепления целлюлозы (и, в меньшей степени, гемицеллюлозы). Кроме того, разрабатываются Н,СОН ! СО ! СН, Рнс.
13.13. Структура лнгннна. Представлены лищь некоторые нз возможных способов соединения остатков фенилпропана 1цгестнуглеродного ароматического соединения, содержащего алкяльную группу). Биодегралация и утилизация биомассы 297 эазогиоканаза, которая расщепляет разорванные целлюлозпые цепи с нсредуцируюших концов с образованием гя(кзкозы, цещ(обиозы (два остатка глюкозы) и цсллотрнозы (трн остатка глюкозы) целлобиогидролаза, которая часто присутствует в целлюлолитнческих грибах и является разновидностью экзоглюканазы, отшспляюшей фрагменты из 10 н болыпего чии(а ос- У некоторых микроорганизмов они входят в со- став целлюлосомы — белкового комплекса, на- ходящегося на клеточной поверхности. Эти ферменты следующие: эндоглюканаза, которая гидролизует )3-1,4- связи между соседними остатками глюкозы в неплотно упакованных областях целлюлозы, образуя разрывы в середине цепи (рис.
13.15) Область с неплотной у«аковкой пеней Кристаллическая струк~ура целлюлоза Цеялобноза цеяяотрноза Глюкоза )(-Глюкоз«лаза Гцеяяобназа) Рис. 13.15. Гзнолеградаг(ия целлюлозы. Гидролиз цепей начинается с расщепления эндоглюканазой )3-1.4-свя- зей в неплотно упакованных областях. Затем экзоглюканаза(ы) и целлобиогидролаза(ы) отщеплюот алигосаха- рилы с нерелуцируюшего конти частично гилролизованных цепей. Далее ()-глюкозидаза катализирует превра- щение целлобиозы и целлотриозы в глюкозу.
2ЧЗ ГЛЛВ>Х 13 татков глюкозы с нередуцирующих концов молекул целлюлозы ° 1)-глюкозидаза, или целлобиаза, которая катализирует превращение целлобиозы и целлотриозы в глюкозу (рис. 13.15). Расщепление целлюлозы с помо>цью целлюлолитических микроорганизмов происходит медленно и часто не до конца. Поэтому были предприняты попытки создать с почощьк> генной инженерии микроорганизмы, обладающие более высокой цсллюлазиой активностью.
Для это>о выделили про- и эукариотические гены, кодируюшие отдельные ферменты цсллюлазного комплекса. Прокариотические эндоглюкапазные гены клонировали и идентифицировали с помощью следующего простого, но эффективного подхода. 1.
Клонированием в Е. соВ создали банк ДНК- клонов пеллюлолитического прокариотического организма и выращивали рекомбинантные клетки в течение 12 ч па твердой среде, содержащей селективный антибиотик. 2. Образовавшиеся колонии покрыли слоем а> ара, содержащего карбоксичетилцелл>олозу (КМК), растворимое производное целлюлозы, и инкубировали при 37 'С еще несколько часов. За это время произошло частичное расщепление молекул КМК, находящихся вблизи колоний, которые синтезируя>т и секретируют эцдоглюканазу.
Трансформированные клетки, синтезирующие„но не секретирующие эндогл>оканазу, не способны расщеплять данный субстрат, молекулы которого из-за болыпого размера не проникают в к>етку. 3. Те области, где произошел гидролиз КМК, вываля,ти с помощью не токсичного для бактерий красителя конго красного и раствора хлорида на>рия. Коню красный избирательно связывается с пеллюлозой, окрашивая ее в красный цвет, и слабо связывается с низкомолекулярными сахаридами, окрашивая их в желтоватый цвет.
Обработка хлоридом натрия стабилизирует цвет. Колонии, продуцирующие секретируемую эндоглюканазу, были окружены желтым гало, а фон, создаваемый не- расщепленной КМК, имел красный цвет. С помощью этого подхода были выделены гены эндоглюканазы из Впер>отусея, С!оягг>тдит, ТЬегтоапае>оЬас!ег, ТЬегтотопоярога, Еги !и!а, Ряеи>(отопая, Се!!г>Ь»'о, Яит>пососсия, СеВи!отопив, ЕйугоЬас>ег и Вас>!!ия.
Для выявления рекомбинантных клонов, синтезирующих экзоглюканазу, использовали иммунный скрининг, позволяющий идентифицировать белок-мишень с помощью специфичных к нему антител; секреция белка при этом необязательна. Рекомбипантные клетки лизировали (п гйш (парами хлороформа), перенесли цитоплазматические белки на найлоновый или нитроцеллюлозный фильтр и провели иммунологический тест. Использованный при этом метод реплик позволил сохранить жизнеспособные клетки для дальнейших исследований. Прокариотические ~3-глюкозидазнь>е гены выделяли с помощью трансформации Е. соВ банком ДНК-клонов, полученным из продуцирующего данный фермент микроорганизма, и отбора трансформаптов, способных расти на чинимальной среде с целлобиозой в качестве единственного источника углерода. Клоны, проявляющие р->люкозидазную активность, можно также выявлять с помощью среды, содержащей хромогенный субстрат (например, 5- бром-4-хлор-3-индол-()-В-глюкопиранозид), или целлобиозно>о агара Мак-Конки; в этих условиях колонии окрашиваются в красный цвет.
Выделение эукариотических Неллюлазных генов Скринннг кДНК- или гсночных библиотек с помощью гибридизации с гетерологичным зо>щом не очень эффективен при идентификации целлюлазных генов, поскольку их нуклеотидные последовательности довольно сильно различаются у разных орщнизчов. Поэтому нужны новь>е подходы для вь>деления мРНК целлюлолитичсских ферментов из грибов или растений.
К сожалению, эти мРНК составляют лишь небольшую час>ь суччарной чРНК, поэтому приходится обощщать библиотеки этих>и мРНК или кДНК и элиминировать кДНК-клоны, не несущие последовательности-мишени. Для выделения некоторых генов эукариотичсских целлюлаз использовали метод «дифференциальной гибридизации», суть которого состогп в следующем (рис. 13. 16). Вмращнванке клеток л лрисуютвин целлюлозы | | мРНК Выращивание клеток без целлкюозы мРНК | Трансляция вбссклсючной Нлентификацня целлюлазных мРНКнфракций системе мРНК кднк-зонд, Баии кДНК-зонл кДН К-клоиов Выделение кДН К-клонов, т брилизующихсл только с вДНК нз ннлулнроваиных клеток .
Целлюлазные кДНК-клоны Выделяют мРНК из клеток, выращенных на среде без целлюлозы (неиндуцировапных клеток), и клеток, которые для увеличения продукции целлюлаз были выращены в присутствии целлюлозы или ее производных (нндуцировапных клеток). 2. Каждую популяцщо мРНК фракционируют в градиенте плотности сахарозы. Проводят трансляцию мРНК каждой фракции в бесклеточной системе на основе ретнкулоцитов кролика илп зародьпцей пшеницы. Определяют мол.
массу соответствующих белков и проводят иммунологический тест, с тем чтобы идентифицировать фракцию (или фракции), содержащую мРНК целлюлазы. Разделяют продукты трансляции в полиакриламидпом геле и выявлягот полосы, происходящие от индуцированных клеток и отсутствующие для неинлупированных; ма- Рис. !3.16. Идентификация кДН К-клонов, кодирукнлих эукариоп1ческис цсллюлазы, с помошыо лиффсрецциальцои гибрилизапии. Ьиодеградацив и утилизация биомассы 299 мрн К из ннлуцированных ююток Готбор гнбрилое) териал зтих полос и представляет собой белки, синтез которых бьш индуцирован целлюлозой. 3.
мРН К-фракции индуцированных клеток, детерминирующие синтез целлюлаз, и нх «партнеры» в градиенте плотности сахарозы мРНК неинлуцирояанных клеток по отдельности используют в качестве матриц для синтеза кДНК. 4. кДНК ипдуцированных клеток клонируют в плазмидном или фаговом векторе, вводят в Е. со(й высева1ог на чашки, делают реплики и проводят скриниш, используя в качестве гибридизационных зондов радиоактивно меченную кДНК фракций из индуцированных и неиндуцированных клеток. Клоны, гибрилизующиеся с кДНК индуцированных и нс гибридизующиеся с кДНК неиндуцированных клеток, могут содержать целлюлазные МЮ ГЛАйА )3 гены, поэтому проводят их дальнейшее изучение.
5. Чтобы доказать, по позитивные кДНК-клоны действительно кодируют целлюлазы, их ДНК гибрилизуют с суммарной мРНК индупированных клеток, проводят трансляцию гибридизовавшейся мРНК ш гйго в бесклеточной системе и идентифицируют полученные прсдукты с помощью антител, специфичных к ферментам целлюлазного комплекса. 6. Определякп нуклеотидную последовательность каждого позитивного кДНК-клона и устанавливают, какие клоны кодируют одинаковыс, а какие — разные белки целлюлазного комплекса.
Эту схему можно использовать для выделения любых индуцибельных эукариотических генов. Манипуляции с це шюлазнылш генами Клонированпые целлюлазныс гены можно использовать в разных целях: для облегчения очистки рекомбинантных белков с помощью связывающего целлюлозу ломена; для получения коммерческих продуктов (например, зтанола) из цсллюлозных отходов с помощью микроорганизмов, в которые встроены целлюлазные гены. Молекула целлюлазы обычно состоит из трех доменов: каталитического, шарнирного, часто обогащенного остатками пролина, серина и треонина, и связывающего целлюлозу. Каталитический и связывающий домены функционируют независимо друг от друга.
Такое разделение функций можно использовать, включив нуклеотидную последовательность связывающего целлюлозу домена в состав химерного гена, друпгя часть которого кодирует представляющий коммерческий интерес белок. Чтобы очистить полученный белок, его экстракт пропускают через колонку, набитую целлюлозой. С целлюлозой связывается только гибридный белок; его элюируют и удаляют «целлюлозный» домен протеолизом. Эта система сходна с иммуноаффинной хроматографией, но обхолится лешевле Ьолыпинство цшиюлазных генов исходно клони(ювали и экспрессировали в Е. со((, но их можно ввести в другие микроорганизмы и полу- чить новгяе штаммы с полезными свойствами. Так, Х сегег)яае и У.
гпгяя((ь эффективно преобразующие в этанол простые сахара (например, глюкозу) после введения им целлюлазных |снов, могли бы превращать целлюлозу непосредственно в зтанол. Для проверки этой гипотезы провели ряд исследований. В олной из серии' экспериментов гены эцдои экзоглюканазы бактерии СеИи/огпопаг ()гпй кажлый из которых находился под контролем промотора и сигнальной последовательности 5.
сегеияае, субклонировачи в плазмндном векторе и ввели в 5. сегеияае. Некоторыс трансформангы секретировали оба фермента в культуральную среду с эффективностью примерно 70% и частично расшешили целлюлозу, входя1цую в состав фильтровальной бумаги и предварительно обработанных древесных стружек. Скорость и степень гидролиза этих субстратов возрастала при добавлении в смесь ))-глюкозидазы, расщепляющей целлобиозу до глюкозы, но полного гидролиза целлюлозы не происходило.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
