Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 89
Текст из файла (страница 89)
Ученые надеялись, что благодаря этим исследованиям удастся создать более эффективные азотфиксирукпцие микроорганизмы, способствующие повышению урожайности сельскохозяйственных культур, а некоторые исслелователи даже предполагали ввести бактериальные гены фиксации азота непосрелственно н растения, чтобы такие растения могли сами фиксировать азот. И хотя щи чересчур смелые планы не удалось осуществить, процесс фиксации азота бып детально изучен, так что возможность генноинженерного усовершенствования некоторых диазотрофов стала более реальной. Все известные нитрогеназы содержат два кислородчувстнительных компонента: ! и Н. Комцонент ! — это комплекс из двух а-субъединиц (массой примерно 50 000 Да каждая), двух (3- субъсдин иц (примерно 60 000 Да каждая), 24 молекул железа, двух молекул молиблена и железомолибденового кофактора, обозначаемого РеМОСо (рис.
14.1). Компонент 11 состоит из двух о1-субъединиц (примерно 32 000 Да каждая) и из неизвестного числа молекул железа, причем его о1-субъединицы нс аналогичны таконым в компоненте !. Для фиксации азота необходимы оба компонента, комплекс ма/ ния и А'ГР, а также источник восстановительных эквивалснтон: !4 + 8Н" + 8с ф 16МОАГР— у — У 2)л)Нз+ Нз! + 16МОА(ЗР 4. 16Рг (1) Рнс. !4.!. Предполагаемая структура железомолибдецового кофаюора, связанного с молекулой азота ()4 ).
Помимо фиксации азота, нитрогеназа катализирует также восстановление газообразного ацетилена ло этилена: Н вЂ” С= —.С вЂ” Н + 2Н' — э Н =С=С=Ни (2) Определяя с помощью газовой хроматографии количество синтезированного этилена, можно оценивать активность нитрогеназы. Опрелслення можно проводить на целых клетках в растворе (рис. !4.2), на бактериях, ассо- Рнс. 14.2.
Онрелеленне активности ннтроыеназн по восстановлению ацетилена ло этилена. Л. бактерии (в культуре нлн ассоциированные с корнями растения), сннтезнрукнлне ннтрогеназу, либо препарат очищенного Фермента (не показано) помещают е герметичную емкость в азмосферу ацетилена. Б. Из емкости периодически отбнра1от пробы н метолом газовой хроматограФии измеряют колнчес1во ацетилена н этилена.
Активность нитрогеназы пропорциональна количеству образовавшег ося этилена. Бактерии, стнмулнруюнлнс рост растений 309 цнированных с корнями растений, на грубых экстрактах клеток или на высокоочищснных препаратах фермента. Компонент ! катализирует собственно восстановление )ч, а компонент Н служит донором электронов. Оба онн чрезвычайно чувствительны к кислороду н при слишком высоких его концентрациях быстро и необратимо инактивируются. Функционирование нитрогеназы зависит также от 15 — 20 вспомогательных белков. Роль некоторых из них состоит в передаче электронов 310 Г(1АВА !4 компоненту 11, а также в биосинтезе железомо- либденового кофактора.
1еипал ипженерил «пастера генов нитроген азы Фиксация азота — очень сложный процесс, требующий согласованного действия множества разных белков. Поэтому вряд ли можно было ожидать, что вся генетическая информация, необходимая для фиксации азота„будет содержаться в каком-то одном фрагменте ДНК и что этот фрагмент удастся вычленить из генома диазотрофного микроорганизма и перенести в недиазотрофный организм. Следует еше учесть, что физиологические условия в организме реципиента должны быть цодходяшими для функциониронапия активной нитрогеназы.
Более преисмлемый способ вылеления еенов азотфиксации (п(Г-генов) состоял н том, чтобы идентифицировать и охарактеризовать те клоны библиотеки ДНК дикого типа, которые восстанавливают способность различных мутантов данного микроорганизма фиксировать азот. Такой метол называется генетической комцлементацией. Первые гпр-!сны, идентифицированные методом комплементаци и, были выделены из банка клонов диазотрофной бактерии К!е(ел(е((а рпеитоп!ае. Эта хорошо изученная энтеробактерия, которая обнаруживается в почве и воде, а также н кишечнике человека. Схема выделения состоит н следующем (рис.
14.3). 1. Клетки К. рпеитотае обрабатывают такой лозой мутагена, чтобы выживаемость составила примерно 0,! — 1,0%. Некоторые из мутантных клеток, способньее расти на минимальной среде, содержащей источник связанного азота типа 1л!Н4С1, но не в отсутствие связанного азота, вероятно, несут мутацию В еее(-гене; их обозначаеот )л(4Т 2.
Используя эксцрессируюшие ешазмндньее векторы с широким кругом хозяев, создают банк клонов хромосомеюй ДНК К. рпеитоп(ае дикого тина (МГ ') и поддерживают его в Е. сор. 3. Проводят конъюгациео МГ -клеток К. рпеитоге(ае с клетками Е. со((, несуц!ими банк клонов в плазмидных векторах. 4. Трансформированные клетки К реееитоп(ае, приобретшие фенотиц МГ ', отбирают, высе- ная их на минимальную среду, не содержащую источника связанного азота. В этих условиях растут только ечеТ -клетки К. рпеитотае с плазмидой, кодирукццей белок, который отсутствует или нс функционирует в МГ -мутанте. Таблица (4.2 Гены К.
Рпеитотие, участвующие в Фиксации азота, и колнруемые нмн белкн (епн функции) ае7-Гвн Безюк (фупацна) (! ((, В,(т*,Е, К Е и'; г,Т,КГЕ!К ее-Субеолнееееца коли юнвпга ! ннтрогвназы 11-Субъалнннца компонинта ! ннерогвназы Коле понент ! ! пнтроганазы грлаволокинее цнруемт: флавопокснн оконлорапукз аза Сееюез ГемоСо Процаеонне !ылуктазы Лнеентрогсназы Акгнватор Рецраосор Созревание колее юнанта ! Другие, лесееас нееуввееееыв фуцкцнн Фрагмент ДНК н плазмиде, комплементируюший хромосомную мутацию МГ, содержит и!(-ген, который можно детально охарактери;ювать и использовать для ныделения других и!Г- генов. Для выделения других генов, участвующих в фиксации азота, применяли два лодхода. Вопервых, использовали банк клонов К. рпеитоеи'- ае для комплементации независимо возникающих ечеГ -мутантов, увеличивая тем самым вероятность того, что в каждом случае будет выделен другой ге((-ген.
Во-вторых, вьшеленные и!Г-гены использовали н качестве гибридизационных зондов для скрининга банка клонов хромосомнои ДН К К. рпеигпопеае, несущих большие вставки (от 7 ло 10 т. п. н.), исходя из того, что у прокариот гены одного пути биосинтеза обычно образуют кластеры. В результате всесторонних исследований был идентифицирован и охарактеризован весь набор ое(-генов К. рпеитотае. Эти гены организованы в один кластер длиной примерно 24 т.
п. н. (рис. 14.4), который содержит семь отдельных оцеронов„кодируюецих в обшей сложности 20 разных белков (табл. 14.2). Для того чтобы образовалась активная нитрогеназа, все т(-гены Бактерии, стимулирующие рост растений 311 Траясформанзы ХИ к. ряеитояые Рис. 14.3. Выделение яф'-генов методом генетической комплементацни. Для комнлементации МГ'мнтамма А'. ряеитоеиае используется банк клонов ДН К 1ч 11+-клеток. Трансформиронанные клетки отбирают по их способностии расти на минимальной среде, не содержащей связанного азота. З!2 ГЛАВА 14 Ацспьл-Сел + СО Парусят + Сол нес ьчнь ьчь+ н" Комооысьп 1! Гены РНК-тренскрипы Актеваоиьь рсорсссия Рис. !4.4.
Расположение е1Уггеььов е кластере и некоторые кодируемые ими функции. ! сны обозначены заьлавными буквами: красная стрелка пол каждой из групп этих букв обозначаез специфический лреоперон и указывает направление его транскриппии. Стрелки, оьхолящие от оеюзььачеььий генов, показывакл, какое участие е фиксации азота принимают продукты некоторых из этих генов. Р— флаволоксип, РΠ— пируват: флаволоксии оксилорсдуктаза.
должны транскрибироваться и транслироваться одновременно (под регуляторным контролем лфА- н ььф:гсььов). Белок МГА — это активатор транскрипции всех л!Г-оперонов, кроме своего собственного. Он связывается со специфической последовательностью ДНК (5 -ТОТ-1ь1! -АСА-3'), которая находится в каждом промоторе каждого л)~-оперона. Сайт связывания белка МГА находится примерно в о0 — 150 нуклеотидах перед каждым сайтом инициацгти транскрипции. Перед началом транскрипции с л!Гзпроьготора связавшийся с ДН К белок ьь(ГА взаимодейст- вует со специфическим белком инициации транскрипции пзо.
Белок Х1(! — репрсссор. В присутствии либо кислорода, либо связанного азота он действует как антагонист МГА и в результате ингнбирует транскрипцию всех других л1!'-генов. Роль К рлеитошае в общем биологическом процессе связывания азота не является основной. Поэтому в целях модификации процесса фиксации азота почвенными бактериями, представляю!лил!и большой интерес с точки зрения стимуляпии роста растений, были кло- Бактерии, стимулирующие рост растений 3!3 нированы и охарактеризованы п(Гмсны из других источников. При этом п(1-гены К. рпеитгт!- ае использовались в качестве гибрндизационных юндов для выделения соответствующих генов из банков клонов других диазотрофных микроорганизмов. Большинство диазотрофов имеет сходный набор генов, копирующих аппарат фиксации азота, и последовательности ДНК этих генов у разных организмов мало различаются.
Принимая во внимание результаты молекулярно-генетических исследований, вероятно, можно повысить уровень фиксации азота диазотрофными бактериями, модифицируя пКА- и п(гХ-гены. После введения с помощью методов генной инженерии дополнительных копий п(гА- гена в штамм ЮигоЫит тей!об растения люцерны, зараженные этим рекомбинантным титаммом, достигали больпщх размеров и давали болыпе биомассы, чем растения, обработанные нетрансформированным штаммом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
