Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 90
Текст из файла (страница 90)
По-видимому, аналогичным образом можно поступить с п(12;геном, так чтобы белок МП (негативный регуляторный фактор) стал бы менее чувствительным к присутствию связанного азота. При таком нарушении регуляции микроорганизм постаьшял бы больше азота своему симбиотическому партнеру. Однако имеющиеся данные указывают на то, что не все азотфиксирующне организмы синтезируют белок МП. (у некоторых из них сущсственныс области 1~1П.
могут быть составной частью 1~1(А)„так что полобный подход не является универсальным. Кроме .гого„ увеличение количества азота, которое может фиксировать микроорганизм, ~ приводит к увеличению количества энергии (обычно в форме связанного углерода), необходимой гшя обеспечения метаболизма. Следовательно, рекомбинантный микроорганизм может оказаться неспособным стимулировать рост растения просто вследствие замедления своего роста. Имея в виду всю сложность процесса фиксации азота микроорганизмами, можно сделать вывод, по простого введения в недиазотрофную клетку-рециниент одного илн лвух п(Г'-генов недостаточно для того, чтобы она приобрела способность связывать азот.
Более то|о, даже введение в геном растений полного кластера п(Г- генов длиной 24 т. и. н. не даст необходимого эФфекта, поскольку при той концентрат П1и кислорода, которая характерна лля растительной клетки, нитрогеназа инактивируется. Если же концентрацию кислорода понизить, то растительная клетка всроятнес всего погибнет.
Но в первую очередь попытки создания растительных клеток, способных связывать азот, требуют решения фундаментальных проблем транскрипции, трансляции и регуляции. Например„трудно представить, как будет осуществляться регуляция фиксации, поскольку у растений нет промоторов, с которыми связывался бы белок 141(А. Следовательно, в таком трансгенном растении транскрипция п(1'-генов не будет инициироваться. Кроме того, чтобы реагировать на уровень связанного азота в клетке„все п(Г-гены лолжны находиться под контролем отдельных промоторов, поскольку растительные клетки неспособны процессировать мультигенныс транскрипты.
Учитывая все сказанное выше, приходится констатировать, что создание растений, способных Фиксировать азот, вряд ли возможно. Гидрогеназа Нежелательная побочная реакция фиксации азота — восстановление нитрогеназой Н' до Н (щзообразный водород), в ходе которой энергия (в форме АТВ) расходуется па образование водорода, который в конечном счете просто улетучивается. В результате только от 40 до 60% всего потока электронов, проходящих через нитрогеназнгяй комплекс, передается на Ьп что значительно уменьшает эффективность процесса фиксации азота. В принципе, если бы Н мог превратиться обратно в Н', потери энергии были бы ниже, и процесс фиксапии азота стал бы более эффскти вным.
Устранить же эту побочную реакцию прямым путем невозможно, поскольку она обусловлена особенностями химического строения активного центра нитрогеназы, и если попытаться блокировать ее, изменив структуру фермента, то неизбежно произойдет и уменьшение активности н итра геназы. Метаболизм водорода В середине 1970-х ~олов было показано, что некоторые штаммы Вгаг)уг)пхв)пит амарал(сига могут расти в микроаэрофильных условиях (при 314 РЛАВЛ 14 Рнс. 14 5. Рециркуляция газообразного еюлорола — побочного продукта фиксации азота. Ннтрогепяза катняизи- рует образование водорода, используя зперпею гпдролиза АТР, а гидрогеняза катализирует его утилизацию. Моди!)7!!ко!(ил генов гидрогеппз На изучение гидрогеназ как дназотрофных, так и недиазотрофных микроорганизмов в послед- Уабееее!и /4.3. Оз носительная активность пнтрогеназы и гнлрогеназы и способцосп 6.
Управ!сиен Нор" (5К) и трех Нпр -мутантов (5К1, 5К2 и КК3) стимулировать рост растений'» "У Оенаанте:льнов хчелнряеяннв н ютя Ц1тямм Отноантвльняя нктнвноать Отноаеугвльяяя якзмняовть Отпоанхвльняя сухая Л.уароейсяен неггроувня зы гнлрогвнячы масса ряпхення вк РК1 5п2 5К3 1.00 0,93 0,91 0,85 1,ОО 1,27 1,13 1„23 1,00 0,01 0,01 0,01 ! ЛИ) 0,81 0,74 О,б5 'Е Из рвЬпез Аьевсн! ве л1..Юеееев 203е 1255- 1257, 1979. ез Аюявноап юпроевнвеен анвннвзлн по зввнанмоахн каянчвазы внвхнленв, охсзвновлвеенаео еи этилена, ох времени, вктнвн хть ендрогснвзы опрвлвяялн прн помопеее водородное о элвктролв. Оунее мяасв растения включает массу лнахьвв н корнея. Салвркянеее епспв рвссчнхлевмн «вк долю духан массы, прнхоляелуюоя нв взое.
Вав вх енчннн ееормееравнен отноанхвл хна евковнх л ея ралнпвльскога югзмнв низкой концентрации кислорода), используя в качестве источника энергии водород. Для этого они синтезируют фермент гидрогеназу, способную превращать атмосферный Н2 в Н (рис. 14.5). Чтобы пропер!ить, можно ли с помощью этих н1таммов влиять на рост сои, растения инфицировали В. !арпи(сввп синтезирующими гидрогеназу (Нпр'). Растения давали ббльшую биомассу и усваивали больше азота, чем те, которые были заражены Нпр -штаммами, даже несмотря на более высокий уровень нитрогеназной активности последних (табл. 14.3).
По результатам этого и аналогичных экспериментов был сделан вывод, что наличие системы ассимиляции водорода у симбиотических диазотрофов типа В. 7п)епп!гит повииеаст их способность стимулировать рост растений, по-видимому, в результате связывания и рсциркуляции газообразного водорода, образующегося в клубеньках при участии нитрогеназы (рис. 14.5). Несмотря на выгоды, которые получает растение от симбиоза с диазотрофным микрооршнизмом„обладаюгцим системой повторного использования водорода, в природных условиях такая система при участии штаммов ЮигпЬуипу встречается редко. Согласно результатам тестирования, представленным в табл. 14.4, большинство рассмотренных природных штаммов ВЬ!ООЬуит и ВгадугЬггоЬуит имеют фенотип Нир .
Было проверено по несколько штаммов каждопу из уюззанных видов, а для В. /ирплкипу их было более !400. Ясно, е1то как только удастся достаточно подробно изучить генетическую природу гидрогеназной системы и идентифицировать соответствующие гены, коммерческие Нпр -штаммы ЛЬ!2ОЬуит будут первыми кандидатами на превращение в пггаммы с фенотипом Нпр"'. Бактерии, сзимулируюшие рос! растений 315 Таблица )4.4. Доля природных нпаммон КлсбрЬигзп и Вгас)3 ~йсобсит, у которых есзь система ассимиляции нолорола (Ннрз-) в Гптаммы Нпр+, агб Кьипипю аипзгпсппспгпгп Ьк сгжпюаптгпю Киса!а!пап три!оп Ктспбгью сркцпгнппппгрп~ ни см/плл Клкрбспгп !кептттппгт Ьм рипзеол Кгпймбйпыпю гпрппггпю ЛгпА~Ьсспьспгп 50. 2! 0 0 2! 9! 0 параболы Еаао ага!.Аюп.
Кег. Чаюбгр! 43: 335-36!. !98с ние 20 лег было затрачено много усилий, и тем пс менее строение и функции этих ферментов до конца не установлены. Многие микроорсанизмы сингезирузот более одной гидрогеназы, при этом часто они состоят больше чем из одной полипептидной испи. Одни пздрогеназы только снязывают атмосферный водород, в то время как другие при соответствующих ус:юанях могут также синтезировать его. Из всего этого следует, что вряЛ ли для преобразования штамма Ннр Хд!!собрат в Ннр будет достаточно простого включения в его геном гена одной из гилрогеназ.
Включенный !ен(ы) должен колировать все субъединицы фермента, который дол жен быть совместим с зле ктронтранспортной системой организма-хозяина. Наиболее распространенная стратегия выделения генов гидрогеназ — генетическая комплементация. Первый из таких генов, ген мембраносвязанной гидрогеназы Е. саВ, был идентифицирован методом комплементацин у мутантной Е со!1, неспособной синтезировать активную гидрогеназу, с использованием банка клонов ДНК Е. еоВ дикого типа, созданного с помощью плазмиды рВК322 Мутант, содержащий дефектную мембраносвязанную гидрогеназу, не рос на минимальной среде в присутствии формиата„при этом активность эндоплазматической гидрогеназы оставалась неизменной. Трансформированные клетки, способные расти на такой среде, проверяли на присутствие в них активной гидрогеназы.
Трансформант, у которого активность гилрогеназы восстановилась до такого же уровня, как у штамма дикого типа, содержал плазмиду, копирующую белок мол. массой примерно б0 000 Да, что соответствует мол. массе одной из субъединиц мембраносвязанной гидрогеназы Е сой'. Дальнейшие исследования показали, что в гилрогеназную систему Е. саВ входит множество генов.
Затем были идентифицированы гидрогеназные гены (Лир) В. !арал!сит; для этого использовался банк клонов ДНК дикого типа, созданный с помощью космидного вектора р).АГВ! с широким кругом хозяев, и мутанты Ннр В. сараи!еит. Присутствие гидрогеназы„связывазощей атмосферный водород, н трансформированных мутантных клетках Нор определяли по способности активного фермента восстанавливать метиленовый синий в атмосфере водорода.
Более детазьное исследование показало, что лир-гены В. )аротеит образуют по крайней мере дна, а возможно, и три оперона, охватывающих примерно 15 т.п.н, причем )!ир-гены Л)!ссобсит !ебит1- поеапгт аналогичны таковым В. )прог!!сиги как н отношении нуклеотнлной последовательности, так и в том, что касается организации генов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
