Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 93
Текст из файла (страница 93)
14.8. Структура силеро4юра псевдобактииа, продуцируемого ппаммом Рзея<)отавах В)0. С ошюй молеку- лой сидерофора связан олин иои Ее(Ш). Антибиотики Один из наиболее эффективных механизмов, которые использук>т стимулирующие рост растении бактерии для подавления пролифсрапип разных фитопатогенных микроорга»измов, исследуется возможность использования их для создания более эффсктивпых систем биоконтр<эля. Многие стимулирующие рост растений флуоресциру>ощис псевдомонады секретируют сидерофор, прелставляющий собой линейный гсксапсптид, которыи состоит из чередующихся (в и Е>-аминокислот и связанного флуоресцентного хромофора (рис.
14.8). Один из таких сидсрофоров, так называемый псевдобактин, обладает сродспюм к Ее(П() = 10м л моль '. Сходные сидерофоры синтезируют все флуорссцирующис псевдомонады. Предприняты также первые попытки исследовать синтез псевдобактипа у стимулирующей рост растений бактерии Рзеи<2отолпз рщ><(а %С8358. С помощьк> мутагенеза были получсны 28 мутантов этого микроорганизма, не способных синтезировать силсрофор. Их отбор осуп>ествляли по: 1) отсутствию флуоресцепции в УФ- свете; 2) неспособности к росту в присутствии дипиридила — вещества, связывающего большую часть желсза в культурш<ьн<>й среде. При очень малых концентрациях >юноа железа растут только те клетки, которые синтезируют сидсрофоры.
Был создан банк клонов ДНК Р. рийг>а *>эС8358 с помощью космидного вектора р1 АЕ)с! с широким крутом хозяев и путем коньюгации осуществлспа трансформация всех 28 мутаптпых форм. Трапсформанты были проверены на способность к флуоресценпии в УФ- свете и/или способность к росту в присутствии дипиридила. Идентифицированы тринадцать разных комплсмснтирующих космидных клопов со средним размером вставки 2б т. п. н. Детальные исследования показали, что эти клоны со<пвстствуют по крайней мере пяти <эгдельным кластерам генов. Один из этих кластеров был исследован более детально.
Его минимальная длина составила примерно 33,5 т. п. н., он содержал пять опсронов по крайней мере с семью отдельными генами. Таким образом, как и фиксация азота и образование клубспьков, биосинтез сидсрофоров— это сложный процесс. Поскольку кажлый сидерофор кодируется несколькими генами, получение рскомбинаптиых бактерий, способных синтезировать модифицированный сидерофор,— задача не из легких. К счастью, сеть другие способы повысить эффскптщхтгь использования бактерий, стимулирующих рост растений, в качествс инструмента биоконтроля. Например, можно расширить круг узнаваемых одним бактериальным штаммом комплексов железо — сидсрофор, так чтобы один рскомбипа»тпый штамл< мог узнавать и использовать сидсрофоры, синтсзируемые друп>ми почвенными микроорганизмами, повышая тем самым свою конкурентоспособность.
Для этого были кгоцированы гены репепторов комплекса железо — сидерофор одной из бактерий, стимулируклпих рост растений, и введены в другис штаммы. Бактерия, с >нм>жнауищяя ай<у авеюннй Огсуггщ)вт Р. 1>ивнев<низ СНЧ> Р 17«<згщзввпл С НАС, спдержщпвя вея гпр Р)>«мелле>н СНАО. содержащая ввктпр с геном грп<) 382 386 365 <и 177 146 335 371 21' фитопатогс>к>в, — син>сз антибиотиков. Так, псевдомо> еды, использующиеся для биокончроля, синтезируют какие антиби<п ики, как агроцин 84, агроцнн 434, 2,4-диацстилфлороглюцинол, гербиколин, <х>мицин, феназины, пиолутсорин и пирролнитрип. Способность бакчер><й, стимулируя)щих рост растений, подавлять пролифсрацию фитопатогенов можно повысить, если ввести в эти бактерии гены, кодирующис биосинтез антибиотиков, которые обычно синтезируются другими бактериями.
Это позволит расширить спектр фитопгггогснов, рост к<порых способна подавлячь одна бактерия. Более топ>, ограничивая размножение других почвенных микроорганизмов, секрстирующис антибиотик бактерии, стимулирующие рост растений, облегчают свою собствсш<ую пролифсрацию, поскольку умсцьписчся число конкурентов за ограничснпыс пищевые ресурсы, а с помощью методов генной инженерии со временем удастся увеличить выход бактсриальных а>пибиотиков. Си>пез большинства противоц>ибковых мстаболитов, продуцируемых псевдомонадами, по-видимому, контролируется белкам, который действует как общий регул>ггор транскрипции; следовательно, уровень синтеза антибиотика можно повысить изменением об>цсй рег)л><ции. Например, в случае Рдеи<готог<<25 37иогезсеиз СНА0 еп) удалось повысить с >юмощью трансформации микроорганизма вектором, несу>пим ген «домашнего хозяйствав гроб, который коли- руст <5>О-субъединицу РН К-полимсразы.
!'Скомбинаптпыи шчамм лучше защищал корни растений огурца от >юврсждсний, вызываемых грибом Ругй<ит и111тит (табл. 14.7). В другом исследовании синтез антибиотика пиолутсорина тем же микроорп>низмом стимулировали инактивацией генов Рф), участвующих в биоси<пезе пирролхип<цпшхинона — кофактора различных гидрогепаз. Механизм такои стимуляции до конца цс ус>ановлен; возможно, в результате мутации поток мстаболитов от других рсакций биосинтсза переключается на биосинтез пиолутсорипа. В >шсп)ящсс время па рьщкс имеется только один рекомбинантпый микроорганизм, использующийся для биоконтроля: АБРОЬисгепит ги<51ОЬасгег К84.
Этот штамм продастся в Австра- Бак>ерин, стимулирукнцие рост растений 323 Тп<ьзиип 14.7. Влияние дополнительных копий гроб'- гена Руги<>огпоппл)>ипгезсепз СНАО ид щп>спбносп эчой бак>ерин защищать корни растений огурца о> повреждеПнй, ВЫЗЫВПЕМЫХ ПатОГЕПНЫМ ГрИбОМ РРЕЬ1ит <<111- тит') Средняя масса свежею япйня, мев в птсугву>ее в прнеутс>внн Р. «Л<зиии Р. и!имат '> Из пвб<пы звйийвг в< в>., 2 а<а!ело!. 177: 5>я)-5352, >995. з> В пзв>твзвнв Р 1>а«и«ель <'НЛО <я<блям«вся значиельнвв звмвд иднв рпвзв карман, вбуслввлвннвв ив«пнем пвзвзвннвгв ~Пнем Р, «Вал«м Ко<ля плвзмнднын вск<вр, к<попым П>внвфврмнрпвллн Р 1Ьатмви СНЛО, сод«ржи хвн хдв<1, звщнзный н>хыхз бвкжрнн был ~првзао боль<ив.
Мвсву корней вппвлв.вын посл« вырвлнвв<~на >хзвзвннй ввпрвдвзвниых увловнях в гь ~вднх 2 нвл. лии начиная с 1989 г. как срсдство борьбы с коропчатым галлом — болезнью, которук) вызывает А8РОЬасгепит 1ите~ас1елз. Заболеванию подвержены миндаль и косточковые плоловые лерсвья, такис как персики, А. Ри<11ОЬ<<стег синтезирует антибиотик агроцнн 84, пжсичный лля А.
1«те~ас1елу. Однако при случайном попадании В НЕГО ПЛазМИды от А. Рай>>ОЬасгег, содержащей гены биосшпеза а>роципа 84, могуч возникнуть агроцинустойчивыс штаммы А. <ите~ас1епк <)тобы избежать этого, из плазмиды рАБК84, песушсй гены биосиптеза агропина 84, был удалец участ<ж, ответственный за перенос плазмиды 1рис. 14.9). В результате штамм А. ни<11<>Ьасгег больше нс мог передавать рекомбина<пную а>- роциновую плазмиду патогснц агробактериям, 1ю сОхранял спОсОбнОсть к бг>око>Г<ролю. Ферд<еиты Некоторые бактерии, стимулирующие рост растений, синтезируют такис ферменты, как хитиназа, р-1,3-глюканаза, протеаза и липаза, коп>- рые разрушают клеточную степку грибов.
В одном из экспериментов удалось снизить частоту возник>ювения болезней, вызывасл<ых фито- патогенными грибами Юияос1о><1а уо1аг>1„ 5С!его11<<т го17511 и РугЬ1ит и111тит, с помощью штамма Рзеи<>отолаз серие<а„синтезирующего Участок, несущий гены синг щроцнна и ус>ойчивосгн к н Тга-ухает Рис. 14 9. Конструирование неспособной к переносу (Тга ) модификации ила>милы рАВК84 А. ггл>годаггег, кодируюшей гены биосннтеза агроцина 84 и гены устойчнвоогн к нему. Используя рестрнкцнон ную карту рАВК84, из плазмиды вырезали (1) фрагмент, который содержал участок Тпц <лветственный за перенос, вместе с фланкируюп>их>и его г>оследоежгельностямгц и встроили его в плазмиду Е.
соб(2). С помон>ьк> рсстриктазной обрабглки из клонированного фрагмента удалили примерно 80% Тга-участка и часть фланкирующих его послеловательностей (в сумме примерно 6 т.н.н.) (3). Осушоствили гомологичн ую рекомби наци>о между плазмндой Е со(>, содержащей «урезанный» Тпнучасток, и плазмидой рАВКВ4, которая солержала всгроснный в Тпнучасток транспозон Тп5 с >еном усгойчивости к канамицнну (4).
1(олучнлн несколько производных плазмилы рАьК84 с часгично улаленным Тпнучастком (5). Тга -плазмида РАВК84 больше не могла передаваться друго)1 агробакгерин в ходе коньюгацни, но все еп>е была способна лстсрминировать синтез агроцица 84 и обеспечивать уогойчивосгь к нему. Рисунок выполнен без соблюдения масцпаба. Бактерии, стимулирующие рост рас>ений 315 фермент )>-1,З-глюканазу, который разрушал грибнои мицелий.
В холе других исследований было показано, что противогрибковая активность трех штаммов Ел>ею)>асгег ад~!о>пега»дч стимулирующих рост растений, обусловлена наличием у них комплекса из четырех разных полипептидов, которые, действуя совместно, расщспля>от хитин клеточной стенки >рибов. Эти бактерии хорошо защищали растения хлоп >атника от заражения Ииеасгоп)а зо)апй В то жс время Тп5-мутанты Е.
аяя!атегапз, пе продуцирующие активной хитипазы, не были способны защитить растения от патогенных грибов. Многие бактериальныс ферменты, разрушающие клеточную стенку > рибов, в том числе хитиназа и 1)-глюканаза, кодиру>отея одним геном. Было бы разумно вь>делить эти гены и ввести нх бактериям, стимулирующим рост растений, с тем ч>обы получить штаммы, синтезирующие, например, и антибиотики, и ферменты, разрупгающие клеточную стенку грибов. Были проведены эксперименты, в которых ген хитиназы, выделенный из бактерии Яе>таба тагсезсепз, был перенесен в клетки 1г(сЬог)егп>а Ьа>х>апип> и К.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
