Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 97
Текст из файла (страница 97)
Григ!пре>>ь!ь ьцЬьр. ВшъгаИ состоит в его дороговизне: стоимость такого препарата в 1,5 — 3 раза выше, чем химических инсектицидов. йи биокон>роля численности насекомьж-вредителей распыляют 1,5 1(г — 2,5 10" спор В. В>напрет!5 ьпЬьр. ВиггааИ на каждый квадратный метр обрабатываемого участка. Обработку проводят в тот период, когда число личинок в 5>опуляц>ии насекомого-мишени максимально, поскольку параспоральные кристаллы чувствительны к солнечному свету и быстро разрушаются.
В лабораторных условиях на свету за 24 ч разлагается более 60ого остатков триптофана в белках параспорьчльного кристалла, а в окружающей среде в зависимости от освещенности кристаллы могут сохраняться от одних суток до одною месяца. Такая нестабильность инсектицидного протоксина подразумевает, что появление устойчивых к нему насекомых маловероятно. Однако в том случае, когда В. Яипнретй ьцЬьр.
/ГигьгаИ использовали в качестве инсектицида В усло>>иях малОй Освещенности (например, в зернохранилищах), через несколько генераций появлялись устойчивые к токсину насекомые. Одна из причин такой передаваемой по наследству устойчивости заключается в изменении мембранного белка клеток кишечника, в норме выполняю>це>о функцик> рецептора токсина В. Яиг>прель>л ьцЬьр. ВиглгаИ.
Возможно. она возникает вследствие того, что в этих условиях протоксин не разрушается и служит фактором отбора. Из всего этого следует, *по появления насекомых, устойчивых к В. Яиг!пд!епь!ь | Цснзпи4зугирсгзяиис в СлС! Хрсмоссмнля ДН К Плязмвлняя ДНК РПК в г ралиссстс Мзльсс сыязмялы Спслгссзс сззсязмсглгя Большие влсзмилм Фракцмоввровянвс О Дво Фракции Верх зп(ззр. ссигзгаИ, проще всего избежать, если ограничить применение данного микроорганизма полевыми условиями.
Впрочем, имея в виду масштабы непользования В. Сйигслйсепясь, нельзя исключить, что может произойти его накопление в среле в количестве, достаточном для того, чтобы вступил в действие механизм игбора. А поскольку В. г)сигсссясенлсз используется все более широко в разных регионах, вероятность появления популяций устойчивых насекомых будет )чзелиссиваться. Идесстис7сикация генов токсинов Для создания штаммов В, с)сигснясел.гйг, более зффективно синтезирующих инсектициды и имею- псих широкий круг хозяев, нужно было идентифицировать и охарактеризовать ген(ы) прогоксина, н в первую очередь выяснить, где они локализованы: в плазмиде или в хромосом- ной ДН К.
Чтобы провериты ипотезу плазмидной локализации, штамм В, г)сигсссдселвсз, продупирующий токсин, можно конъюгировать со штаммом, не обладающим инсектипидной активностью. Передача хромосомной ДНК во время конъкпвции происходит крайне редко, и если «дефектный» штамм приобретает способность синтезировать инсектицид„значит, токсиновые гены локализованы в плазмиде. Для идентификации гена, колируктщего протоксин, использусот обычную методику. В.
гС)игслдселзьз выращивают в культуре и лизирукзт клетки. Выделяют суммарную юсеточную ДНК и цент рифугируют ее в градиенте плотности СзС1„чтобы разделить плазмидную и хромосомную ДНК. Если гены протоксинов входят в состав генома, создают банк клонов хромосомной ДНК. Если же они солержатся в плазмиде, то плазмидную ДНК фракционируют по размерам центрифугированием в градиенте плотности сахарозы.
Эго обогащает ту плазмиднукз фракцию, которая послужит в дальнейшем исходным материалом для идентификации генов прогоксинов (рис. 15.3). Ген протоксина В. С)сипсс8сепзсл гцс)зяр. йиксгаИ находится на одной из семи плазмид длиной 2,0; 7,4; 7,8; 8,2; 14,4; 45 и 71 т. и. н. Чтобы определить, в какой именно, проводили центрифугирование плазмидной ДНК в градиенте плотности сахарозы. Были выделены три фракции, в кото- Микробныс ииссктицилы 335 Суммярнггя бякгсрззальгсяя Д11К Рис. 15.3. Выделение и фракционироваиис плазмид, одна из которых несет ген протоксина.
рых концентрировались малые (2,0 т. и, н.), средние (7,4; 7,8; 8,2 и 14,4 т. п. н.) и большие (45 и 71 т. и. н.) плазмиды. Малые плазмиды из рассмотрения были исклочены, поскольку они не мопси кодировать белок мол. массой 130 кДа. Длина нуклеопщной последовательности, кодирующей белок такого размера, должна превьппать 4,0 т. п. н. Средние и большие плазмиды подвергли частичному гидролизу рестрицирусощей зндонуклеазой ЛассЗА! и фрагменты встроили в лкстН1-сайт плазмиды рВК322. Полученными рекомбинантными плазмидами трансформировали клетки Е.
гос7, а затем провели иммунологический скрининг по следующей схеме: Збб КЛАВА 15 1. Колонии клеток перенесли с агара на нитроцеллюлозный фильтр. 2. Перенесенные клетки частично лизировали органическими растворителями. 3. Все сайты неспецифического связывания первых и вторых антител на фильтре блокировали с помощью бычьего сывороточпого альбумипа (ЬСА). 4. Обработанные БСА фильтры инкубировали с кроличьими антителами к искомому ипсектипиду. 5. Отмывали фильтры от несвязавшихся антител и обрабатывали пз)-меченньсм А-белком Вгорйу1ососсиз аигесм, который взаимодействует с Гс-фрагментом связазшых антител.
б. Области на фильтре, которые соответствуют колониям, активно синтезссруюпзим инсектицид, вьсявляли с помощью ралиоавтограф Используя идентифицированный ген протоксина в качестве гибридизационного зонда, установили, что соответствукяцая нуклеотидная сюследовательность содержится в плазмиде В сйсспаясеазсз зпбвр. )сантса)сс'длиной 71 т. и. н. Аналогичная схема клонирования и скрининпс использовалась для идентификапии генов токсинов, локализовшшых в плазмидах или (реже) в хромосомной ДНК лругих штаммов В. Гйигснь)ензсз.
Й нная инженерия генов токсинов В. ЯигйсрепзЬ После идентификации токсинового гена В. сйипсжсеазсз была определена перви шая структура копируемого им белка. Сравнение ампнокислотных последовательностей разных белковых токсинов показало, что белки некоторьсх ппвммов имеют одинаковый домен, ответственный за токсичпсють.
Кроме топо, был субклонирован сегмент полной копирующей последователыюсги, с которого синтезировался укороченный белок, в полной мере сохранивший свою токсичность. Таким образом, при иослелусопсих генноинженерных манипуляциях мотуг использоваться интактный ген токсина, еп1 фрасмент или химически синтезирова~ шый ол игонуклеотид. Б естественных условиях большинство протоксинов В.
йссгс)сстеазсх синтезируются только во время спорулш сии, т. е. параспоральный кри- сталл образуется только на определенной стадии развития микроорганизма. Если бы экспрессия гена токсина происходила во время всего жизненного цикла, можно было бы существенно увеличить количество получаемого токсина и уменьшить время его синтеза.
Кроме того, зто позволило бы сделать синтез токсина неарерывнылс процессом и тем самым значительно удешевить продукт, поскольку для непрерывной ферментации используют небольшие, а потому менее дорогие биореакторы и оборудование, чем для периодической (более подробно см. об этоис в гл. !б). Во время споруляции В. г)сссгсареазп спещзфический фактор инициации транскрипцин (сигма-фактор) связывается с прсвзоторами генов, функционирующих только на этой стадии жизненного цикла бактерии. так что синтезируются матричные РНК (мРНК), специфичные для споруляцни. Следовательно, чтобы добиться непрерывной экспрессии инсектицилного сена (генов) В, сйипссрепссь необходимо поместить его (их) под контроль промотора, фупкционирующепз в течение всего жизненного цикла.
Для этого фрагмент ДНК. содержащий ген токсина без его собс гвенного промотора, встроили в плазмиду так, чтобы он находился под контролем активного конститутивного промотора гена устойчивости к тетрациклину, который ранее был вырезан из плазмиды ВассВщ сессия и введен в В. гйссгсгсясегсзсз. На всех этапах развития микроорганизма непрерывно синтезнровался полноценный токсичный белок (рис. 15.4). Кроме того, когда этой конструкцией трансформировали мутантный штамм В.
сйсспнясещсз, не спсюобный к споруляции, токсин все равно снптезировался. При этом процесс был гораздо более эффективным, чем в случае В. сйигспяселзьз дикого типа: количество получаемого продукта было больше, а израсходованное количество субстрата и время синтеза— значительно меныпе. Дальнейшее усовершенствование этой системы могло бы состоять во введении токсинового щна, экспрессирующегося в течение всего жизпенного цикла, в хромосомную ДНК штамма В. сйсспгсресмсп не способного к споруляции. Это гарантировало бы сохранность ~сна при непрерывной ферментации, что пе всегда достигается КЕ2 КЕ! Псюмота Геи токсина КЕ! е КГП и КЕ2 К-лигазой тл с помощь Ген токсина 22 — З!ВЗ Рис. !5.4.
Клоннровапие Фрагмента гена токсина В. !Липпе!епзгз зсс!ззр. /сит»гася пол контролем про«клара гена устойчивости к тетрапнклину (рТс!). Из выделенного гена В. !Лиг!плгепзсз удаляют его собственный промотор с помощью рестрпктаз КЕ! л КЕ2. Полученный Фрагмент встраивают в плазмндный вектор рядом с промотором рТе! вместо гена устойчивости к тезрацякляну, улалснного с помощью ресгряктаз КЕ! н КЕ2, и лш ируют при участии ДН К-ли!- азыы Феса Т4. при его плазмидпой локшгнзации вследствие нестабильности гшазмиды.
В отличие от большинства других токсиновых генов (сту) В. г)!истая)етсзтз, экспрессия гена сгуШ4 в норме контролируется «незвтивным» промотором, а не промотором, специфичным для споруляции. Ген сгуШ4 кодирует токсин„эффективный в атношении личинок жесткокрылых. В результате трансформации мутантного штамма В. г!иатггрепзгт, не способного образовывать споры, плазмидой, несущей клонированный ген с!3 ША, токсин синтезировался более эффективно и был более стабильным, чем при его синтезе в штамме дикого типа. Получив этот результат, ученые предположили, что суперэкспрессии других сгу-генов, обычно экспрессирующихся только во время споруляции, можно достичь, если поместить их под кошроль ирам!пора сзуТИА н трансформировать получившейся конструкцией мутантный штамм В. йиггпрепз(т, не способный к споруляции. Мнкробные инсектнпиды 337 Урожаю многих сельскохозяйственных культур наносят ущерб сразу несколько видов насекомых, поэтому чрезвычайно полезным было бы создание микробиологических инсектицилов, направленных против широкопз спектра насекомых-вредителей.
Токсин нгзирокого спектра действия можно гюлучить двумя путями: !) переносом гена лашюго токсина (например, токсина, эффективного в отношении двукрылых) в штамм В, гпгсгсгфезззи, сиепезируюший друпзй видоспецифичный токсин (например, эффективный в отношении жесткокрылых); 2) соединением частей двух генов разных видоспецифичных токсинов с образованием последовательности„кодирующей уникальный токсин двойного действия (гибридный токсин). Чтобы проверить зюзможность получения токсина с широким спектром действия, встроили гены токсинов В.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
