Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 98
Текст из файла (страница 98)
Всиппрегсзсз зпЬзр. а!таска! н ьвпебпопм в челночные векторы, способные реп- 338 ГЛАВА 15 Клонирование и экспрессия гена,кодиру(ощего токсин 2)аеИил Ишеглрепяу, в Еле)геггсйгп еп11 Н. Е. Кс)(верб Н, К. 'т(С)з((е1еу Ртаа. !та!1. Агац ать (15А 785 2893 — 2897, 1981 водить скрннинг трансформантон Е. сп11, несущих ДНК В. СЬиплл)плыл; с помощью иммуноло( ических методов с использованием антител к целому кристщщу или путем определения инсектицидной активности экстрактов трансфорлщнтон.
К тому времени были получены некоторые указания нато, что гены токсинов расположены в плазмиде, поэ)ому были в)ялелены н фрнксзыонслронаны зьчазмнды, возможно несущие нужнь!е гены. Высказывались предположения, что антитела к целому крисиллу, н котором белковые молекулы гликозилнронаны„мо- лпцироваться и в В. !Вист!!я!етбт, и в Елсйес!сй(а со!1. Затем такие генетические конструкции авели с помощью электропорацни в В. СЬ(сг(г(д(е)1589 вц))вр, а(га)уа(, Ыи1ае(, впие1елзи и 1елеЬгьвлбь Токсичность полученных трансформированных штаммов проверяли на личинках трех отрядов насекомых. Во всех случаях токсичность, обусловливаемая собственным хозяйским токспновым геном (генами), сохранялась, а в большинстве случаев введенный геп обусловливал специфичность токсического действия, характерную для штамма, откуда он был выделен (табл. 15.2).
Кроме того, один из экспериментов лал совсем уж удивительный результат: при введении гена токсина В. 1йиг(ля(ес)585 вцбнр. СелеЬпалсз в В. СЬ(сгсля(ес(989 хц))бр. 15ган1елз15 получились трапсформанты, в какой-то степени токсичные для Р(енз Ь а851спе (капустницы белой), ца которую пе действовал ни один из продуктов исходных генов. Плазмидные векторы, несуп(ие клонированцые с)у-гены, часто оказываются нестабильными в В.
11пссел(епу(лл даже в отсутствие селектнвного давления все они или их часть утрачиваются. Интересно, что при этом в природе большинство сгу-ге( юв локализуются именно в плазмидах. Нестабилы юсть плазмнд еще раз убеждает в целесообразности интеграции клонироващюго сгу-гена (генов) с хромосомной ДНК. Рассмотрим один успешный пример такой интеграпии. Габдици 15.2 Токсичность природных и рекомби- нантных Подвидов В. (Ьиг(льчелз15 ЛлЯ насекомых Рсемз ьгагя(ассе (капустшша), Аес(нт аекурл (комар) и Рьаес)ссл сасЬ(нас сне (жук)') такенчппвть плит! Хозяйская ДНК Введенная ДНК Р(тгв АеИьн 2%ивлап Нвт а(таил( Вгае1тпзн 1!тт 1лав1вппз исат1егнд Сснтзсагд Ьисзса1а Сил аЬтюп!з СепвЬлапд асйанас Свпебласиз сепвЬлалп пйаьаз с! Из рант юс Спскюотв в!а!., никнет.
Л 270з 133 — 1)б. 1990. 1! Обозначали>с ч с поврвиданы пт 0 дп 5% явспвв (гыя Р(заваря и Рсллс) нли зыблзтдамв» 100%-ная гибель насвкпыых в зачанин 1 ч (Аааат); ь нпвревдьны ат 5 лп 50% лнатьтв (Рвладлсс и Р(тлт) или иабяюдавтся тибвльпт 50 до !00% смсекпмьсх «твчвние 24 ч (Аадстт);- паврвнюны бахав 50% ливтьвв (Рамлал и Пт З) юзи ни одно нвсакамвв не потнбавт в зачанин 24 ч (Акант). Экспвримвю ы с сроводвли на лнстых «апусты (смя Рсель) илн раны ( лля !'Ьледсп). нно изнесп!о, что параспой кристалл, образующийся х В. !Ьалля(елз(л) облнлаез. ицпдной активностью, одошли многие )оды, прежле ли найлены условия его созации и выделен чин!ый !й токсин. Кроме т(но, хоп обнаружены штаммы ренты) не способные обрать параспоральные кридетлльных протоколов секой трансформации е!де естновало. Поэтому, ко!дн и Уайтли решили идентионать токсиноные гены л8(елт(з) им пришлось про- тут не узнавать субъединицы солюбилизированного криста(ла, состоящие из негликозилиронанного белка, однако эту проблему удалось решить.
В конце копцов были получены трансформапты Е. са11, которые несли геп токсина В. (Ьигглхселт и бьщи токсичны н отношении определенных насекомых. Клонирование первого гена токсина В. СЬнстсля(елзй четко показало, что эти гены достаточно просто получить, и послужило стимулом к более активным поискам новых штах(мон В.
(Ь!с!тля(елди в к исслелонанивм биохимии бпоинсектицидон. долгеп домен 1И домен И СгугС Сгт!Е Сс27 Рзб Штамм В. 1)гигглреггзсг ацбьр. )сгггсга)сг обычно содержит пять разных генов токсинов: гтугА (а), сгугА (Ь), стугА (с), сгу(!А и сгуОВ. Их продукты токсичны для различных чешуекрылых, но не эффективны против Лрос(оргега арр. В хромосомную ДЕ!К штамма В. г)гггггггрелзсс ягЬзр. )сггггга)сг встроили ген стуХС, обычно присутствующий тсглько у В. 1Ьигглдгелгсг зцЬзр. агсавас' и вцЬзр.
«ггготосЫиз. Трансформированный штамм В. 1)гигслфеггсгз ацЬзр. гсигзта)сг был в шесть раз более эффективен в отношении личинок Лросгоргега ехгягга, чем штамм дикОГО тина. Как мы уже говорили„другой способ получения токсина широкого спектра де(йствня состоит в слиянии кодирующих участков генов двух разных токсинов. Эта возможность была проверена в лаборатории. Было создано несколько гибридных токсинов, действующих только на чешуекрыльгх; некоторые из этих токсинов были более эффективны, чем продукты каждого из исходныхгенов, а в одном случае гибридный белок обладал абсолютно новой биолопгческой а ктиш юстью. За токсическое действие белка Сгу ответственны три домена. Домен 1, локализованный в Х-концевой области белковой молекулы, обеспечивает специфическое связывание токсина с рецептором на поверхности эпителиальных клеток кишечника насекомого.
Домен Ш, расположенный в С-концевой области молекулы, цредноложительцо и отвечает за токсичность. Устойчивость к токсинам В. 1)гиггггфеггзгз обычно обусловливается мутационным изменением (из- Рис. 15.5. Токсичность белков Сгу(С, Сгу(Е и гибридных токсинов О27 ц Г26 и специфи*цюсть их связывания с рецепторами. Специфичность связывания определяли а эксперимеггтах цо взаимолеиствию токсина с рецепторолс.
К комплексу белкового рецептора на поверхности клеток кишечника Л. охгягго ц изотоп- но меченного токсина добавляли немеченые Сгу(С цли Сгу1Е и опрелеляли связывание меченого токсина. (Из работы Волей ег а1., Вго/7'ес)гггойоез 12 915-с)18 1994 ) 1ч(икрсйцсые ицсектишшы 339 менениями) рецепторного белка (белков) на поверхности клеток кишечника насекомого, приводящим к тому, что рецептор перестает узнавать Сгу-белок. Однако, если модифицировать ген токсина так, чтобы токсин мог связыватгюя с другими поверхностными белками, то вероятность возгигкновения устойчивости у ме и ьц!итс 51 . Белки Сгу!С и Сгу!Е токсичны для чешуекрылых, но обладают разной видосцецифичностью: Сгу1С действует на Л'.
ехгдиа, Чатезаа Ьгаззгсае и Малсгиса зехга, в то время как Сгу 1Е— только на М. зехга. В одной из лабораторий был создан гибридный белок Сгу! С-Сгу! Е, токсичность которого проверялась на разных насекомых. Бьша исследована также его способность связываться с разли шыми рецегггорами (рис.
15.5). Гибридный токсин О27, содержащий домен П! бе.пка Сгу1С, был токсичен для личинок Л'. ехгдиа, хотя связывался только с Сгу1Е-рецептором, но не с рецептором Сгу1С. И наоборот, гибридный токсин Е2б не оказывал действия на личинок Х ехгдиа, хотя и связывался с Сгу1С-рецептором. Поскольку токсичные для Лй ехгдиа белки Сгу!С и О27 связываются с разными рецепторами ца новерхности клеток кишечника насекомого, одновременная или цоочередная обработка Х елгдиа двумя этими токсинами может уменьшить вероятность появления устойчивого к ним штамма, поскольку для этого необходимо, чтобы мугационные изменения произошли одновремешю в двух разных белках. Токсичность Конкуренция Конлуронпия алл Х екйио за СсугС-сказ за Ссугд-оаяз 340 ГЛАВА! 5 Инсектицид, продуш<руемый В 1Ьи><1«>лзе><х(з ацбар.
с<гае1е»<1з, проявляет свои токсические свойства, когда он попадает в кишечник личинок комара. Если же этот токсин, находящийся в вИне параспоральпых кристаллов, распылить над водой, то кристаллы быстро утонут, и токсин булет исключен из пищевой цепи личинок комара. Чтобы решить эту проблему, люжно ввести ген токсина н организм, который служит пищей для личинок комаров. Это могут быть„например, фотосинтезирую<цие циапобактерии Бу«>есйосузгб< и .5у»ес1и>сосс<сг арр., которые размножаются в >юверхпостном слое воды, гле достаточно солнечного света и гце обычно обитак>т личинки. Еше один организм„который можно использовать для экспрессии генов токсинов В. 1Ь<с>сия>ел<>з, — бактерия Саи1оЬасгег сгехселг<сз, широко распространенная в водной среде, гце живут личинки комаров. Инсектицид, синтезированный трансформированными цианобактериями или С.
ссезселпм, в лабораторных условиях был токсичен цля личинок комара. Однако в нолевых условиях трансфорл<иронанпые циапобактсрни и С. с«езсепгиз быстро погибали, а уровень экспрессии клонированных генов был очень низок. В качестве оргапизма-хозяина лля чужеродных сгу-генов, кодируюших т<>ксичпые для комаров белки, можно использовать также грамотрицательную аэробную бактерию Алйссасаи(гз ехсел1>ии<, обитакяцую у поверхности волоемов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
