Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 100
Текст из файла (страница 100)
11н>г!пя>епув. Более того, устойчивые к бакуловирусам насекомые быстро уграчившот эту способность после п>п>, как прекращаки взаимодействовать с вирусами. Фермеры и садоводы црелночитшот использовать один инсектицидный агент, действую- и!ий на различных насекомых-вредителей, а не множество инсектицидов. Это означает, что для более широкого применения бакулирусов необходимо расширить круг их хозяев. Бы>к> пока>>ано„что при одновременном инфицирования клетки насекомого двул!я штаммами бакуловирусов после их репликации иногда появляя>тся новые штаммы„немного отличаюнгиеся но своим действиям от исход!гых вирусов.
Причшюй этому является гомологи >- Микроб> >ые инсектициды 343 пая рекомбинация между ДНК разных вирусов. Детальное изучение этого явления показало, что рекомбипация осусцествляется в пределах участ- ка ДНК длиной все!о 79 нуклеотидов, расположенного в гене геликазь! р143. Возможно, этот участок и определяет круг хозяев разли шых бакуловирусов. Учитывая все это, можно предположить, что замена в нем некоп>рых нуклеотидов позволит создавать бакуловирусы с более широкой специфичностью.
Таблица !5.4. Эффект некоторых >епов, введенных в бакуловирусы лля повышения их инсектицнлиого действия'> Прилуке ыоо Влиооое, оказываемое на оаеокомоо-холомов Умсмлшеиве объема темолммфы ! >рекроимное питания 1Ътуротическмя гормон Эмери>а к>влили!ъ>лото гормона Токсин Д. !!>иетллсепт Токсин скорпиона клен!ооой токсин 3 олсон осы Прокриилспие питания Паралич Паралич Прежлсоретлон>лал механизация, меллениоо прибавление о лесе ~> Ит работы Метал, Счел Орм.
йемелло!. Ы 3!3 — 3 !9, !995. Уеиз!ение биоконгиролз! с пол!ои(ью генной инзк енерии Бакуловирусы це оказывают свое действие мгновенно. В зависимости от условий инфицированное насекомое может погибнуть за период от нескольких дней ло ! !ескольких недель. Чтобь! ускорить этот процесс, попытались увеличить вирулентность бакуловирусов введением в них чужеродных генов, в результате экспрессии которых произойдет ослабление инфицированного насекомо!о или его гибель (табл, 15.4). В одном из экспериментов предполагалось использовать ген, экспресс>щ которого в клетках насекомоп>-хозяина нарушает е!о нормальный жизненный цикл. Известно, что понижение уровня ювенильного гормона у личинок инициирует окукливание и приводит к прекращению их активного питания.
Это снижение происходит в результате повышения содержания специфической эстеразы, катализирующей превращение биологически активной формы сложного метилового эфира ювенильного гормона в неактивную кислую форму. Ипгпбирование активности эстеразы приводит к накоплению ш у!уо активноп> ювенильного гормона, личинки дольше остаются на стадии активного питания и в результате достигают и!гангских размеров. Разумно было предположить, что прп искусственном повышении уровня экстеразы ювенильного гормона произойдет понижение уровня эндогенного активного ювенильного гормона и преждевременное прекращение питания. К тому же было известно, что при уменыпении времени активного питания личинок урожаю наносится меньший ущерб.
Чтобы проверить это предположение, пришлось сначала провести эксперименты по клонированию и экспрессии гена эстеразы ювенильного гормона. Фермент выделили из насекомшо Ое(сл>г)!сй и!ге!се!!х (сл>вки) и очистили. Определили еп> ами!юкислотную последовательность, синтезировали олигопуклеотид, соогветству!оший одному из сегментов белковой молекулы, и использовали его в качестве зонда д>ш гибридизации. Из библиотеки кДНК )>'. Усгехсенз выделили кодирую!цую последователыиють для эстеразы ювенильного гормона и встроили ее в геном бакуловируса так, чтобы она находилась под транскрипциопным контролем вируса.
После обработки таким рекомбинантным бакуловирусом ХУ!самар!из!а !!! (совки ни), ! щходящейся па первой личиночной стадии развития, содержание ювенильного гормона у насекомого снизилось, а рост личинок резко замедлился по сравнению с таковыми контрольных личинок, обработа! шых бакуловирусом дикого типа. К сожалению, применимость этого подхода д и повышения эффективности инсектицидного действия бакуловирусов ограничивается тем, что ухудшение питания личинок при повышении уровня эстеразы ювенильного гормона происходит только на первой стадии развития личинок.
Личинки, находя!пиеса на других стадиях развития, гл>рмдо менее чувствительны к обработке бакуловирусами. Таким образом, бакуловирусы, специально сконструированные для экспрессии гена эстеразы ювенилы юго гормона„эффективны лишь тогда, когда личинки большей части популяции насекомого-вредителя находятся на первой стадии развития, что в естественных условиях почти недостижимо. 544 ГЛАВА 15 Другой подход к повышению эффективности иисектицидиого действия бакуловирусов основан ги включении в вирусный геном гена мощного насекомоспецифичного токсина, который экспресснровался бы во время цикла вирусной инфекции. В один из ппаммов бакуловнруса был введен геи иасекомоспецифичиого нейротоксииа, синтезируемого североафриканским скорпионом, Ааг(гаетапих аизгга!и Нес(ог.
Этот нейротоксин, пе оказывающий никакого действия иа мышей, блокирует транспорт ионов натрия в нейронах насекомых-мишеней, что приводит к параличу и смерти. Насекомые, которые были инфицированы бакуловирусом, несущим геи нейротоксина скорпиона, повреждали листья контрольных растений на 50% меньше, чем насекомые, инфицированные бакуловирусом дикого типа. Клонирование и экспрессия кДНК токсина израильского желтого скорпиона, Т.е(игиз аигааиехптагиз аебгаеигч в бакуловирусе Аигаягарйа саг(гагтса привело к уменыпеиию времени, которое необходимо лля уничтожения 50% личинок контрольного насекомого, со 120 до 78 ч. Кроме того, через 120 ч после инфекции личинки насекомого, обработанные рекомбииантным вирусом, набрали втрое меньший вес по сравнению с личинками, обработанными вирусом ликого типа. Таким образом, рекомбииангный бакуловирус ие только ускорял гибель инфицированных личинок, ио н сугдествеигю уменьшал способность насекомых повреждать растения.
Не так давно рекомбинантиый бакуловирус А. саг(уоги1са, иродуцирующий насекомоспецифи шый нейротоксин Апг(госрэаиз аилиайз, был протестироваи в полевых условиях. Б проведенных ранее лабораторных экспериментах наблюдалось уменьшение времени, необходимого для уничтожения насекомого 7. т, на 25 — 50%„но еще больший эффект оказывал рекомбннантиый бакуловирус в контрольных полевых испытаниях (рис. 15.7): он быстрее приводил к гибели насекомых, снижал ущерб, причиняемый растениям капусты, сокрагдал число вредителей в следующем цикле репродукции. Какую бы эффективность ии обнаруживал конкретный рекомбннантиый бакуловирус в пв м хо м бо е ло Й го Д о о 5 го !5 Время после оераслпкя, еут Ряе. 15.7.
Выживаемость личинок 7'. и' после обработки листьев капусты бакулоаирусом дикого типа или рекомбипаитным бакулоаирусом, экспрессируюшнм геи пейроюксина скорпиона. Ни контрольные растения наносили только личинок насекомых. Чеы ниже ныжнваемоагь, тем больше личинок погибло и тем больше эффектнепосгь обработки. Растения обрабатывали бакулоаирусами только один раз в начале эксперимента.
лабораторных экспериментах, основным препятствием на пути его широкомасштабного применения является высокая стоимость его препаратов и трудность распространения. Бакуловирусы — это облигатные паразиты, они могут размножаться только в живом организме или в культуре клеток насекомого.
Стоимость препаратов бакуловирусов, независимо от того, является вирус рекомбинантным или пег, гораздо выше, чем химических инсектииндов. И тем не менее не исключено, что биологические иисектициды найдут более пшрокое применение„если учесть, какое неблагоприятное воздействие на окружающую среду оказывают химические иисектиинды, т. е. если сопоставить их стоимость н выгоду, которую опи лают. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настояпгее время микробиологические инсектициды получают все более широкое распространение благодаря тому, что они не оказыаакп вредного воздействия на окружающую среду. Некоторые подвиды бактерии аасИгз гйиггпреа- Рйикробпые ипсектппвцы 345 зсг образуют протоксип, которыи, попадая в кишечник насекомого, в условиях щелочной среды и под действием пищеварительных протеаз превршцается в активный токсин и вызывает гибель насекомого, Летальное действие токсина обусловливается образованием в мембранах клеток кишечника ионных каналов, через которые АТР выходит из клеток.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
