Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 104
Текст из файла (страница 104)
Кроме того, для непрерывных процессов необходимо стсрилыюе резервное оборудование, что значительно увеличивает основные затраты. К качеству компонентов культуралыюй среды, используемой при крупномаспттабной ()1срмснтаци11, нс прсды1вля1отся стОль ВысО- кие требования, как к компонентам среды при ферментации в лабораторных условиях; они могут изменяться от одного процесса к другому, что может приводить к измснешпо физиолопги клеток и снижению производительностити. Репутагщя периодической фсрментации как весьма налсжной систел1ы сдерживает переход к любому другому типу ферментации, даже при юм что непрерывный режим работы более эффективен. И все-таки 11едавно было создано сразу несколько установок, лабораторных (до!О л) и пилотных (до 1000 л), для непрерывной и периодической ферментации с добавлением субстрата — с целью получения белков с помощью рекомбипантных микроорганизмов.
Это говорит о том, что более широкое применение непрерывных ферментеров и периодических ферментеров с добавлением субстрата в промышлснности— это только вопрос времени. Повьниение эффективности ферментииии Независимо от типа биореактора в ходе ферментации необходимо строго контролировать такие параметры, как концентрация растворенного кислорода, рН, температура и интенсивность перемешивания. Слишком сильное изменение лк1бого из них может существенно снизить скорость роста клеток и стабильность белкового продукта.
для оптимального роста Е. Сон и многих Лругих микроорганизмов, используемых в качестве инструмента экспрессии рекомбинантных белков, обычно нужна хорошо аэрируемая культуральная среда. Максимальная скорость утилизации кислорода при ферментации Дл„, зависит от массы клеток Х, максимальной удельной скорости роста р„„, и скорости роста, зависящей от количества потребленного кислорола )о2. Эта зависимость выражается следующей 1)юрмулой: Поскольку кислород плохо растворим в воде (0,0084 г/л при 25 С), он должен подаваться в среду непрерывно. Обычно для аэрации через фсрмснтер продували стерилизованный воздух.
Однако при этом в среде образуются пузырьки, и если они слишком велики, то скорость переноса кислорода к клеткам недостаточна для поддержания их роста. Таким образом, в ходе ферментации необходилю с помощью специального датчика контролировать содержание растворенного кислорода в среде, следить за его равно- 11ромьлпленный синтез белков при участии рекамбинантных микроорга»»измов 355 Экспрессия гена гемоглобина стимулирует синтез белка В Е. соИ в услоаиах недостатка кислорода С. Кйоз1а, ЕЕ.
Сот»ил). ОсМо»)е»»а, 1).ишал, ЕЕ. Ва!1еу Вю/Те»йлм»»ху 8:849 — 853. 1990 ческих соединений, таких как перфторуглеропы, поаьолаюшие расгаоримосп, кислорода; 4) модификапия конструкции»)эерл»снтсра таким образом, чтобы обеспечивались оптимальная аэрация и перемешивание кулыуральной срелы. Все эти подходы рспшкгг «кислородную проблему» лишь частично. да»» каждо» о из них существует свой порог, по Лосгижении которого выход продукта уже нслшя повысить дш»ьнсй»»»им лобавлениел» кисло»»»а»а.
В качестве алшернативы Бейли и др. предложили мод»»Ф»»ц»»- ровать микроор»анизм, использующийся для культивирования, мерным распределенном по всему объему н тщательным перемешнваннем культуры, обеспечивающим эффективное днспергнровапне пузырьков. Большинство микрооршннзмов растут лучше всего прн рН от 5,5 до 8,5. Следует иметь в виду, однако, что клеточные метаболнты, поступая в культуральную среду, могут изменять ее рН.
Таким образол», необходимо тщательно контролировать рН в ходе фсрментацин и прн необходимости добавлять в ферментер кислоту или щслочь. При этом последние должны быгь хорошо перемешаны со средой и равномерно распределены по всему объему. Еще один параметр, от которого зависит успех фсрментации, -- температура. Если она ннжс оптимальной„то рост микроорганизмов замедляется н интенсивность метаболизма снижается. Если жс, напротив, температура слишком высока, то можег произойти преждевременная индукцня си»»тсза белка, если он находится пол контролем температурочувствнтельного репрессора, нлн индукции белков теплового шока, что активизирует клеточные протенназы и снизит выход белкового продукта.
Тщательное перемешиванне культуры необходимо„яо-псрвых, для равномерной доставки п»нательных веществ к клеткам и, во-вторых, для предотвращения накопления токсичных побочных продуктов метаболизма в каком-нибудь небольшом отсеке бнорсактора. Эффективное нсремешиванне относителыю легко обеспечить прн культивировании в небольших объемах, при крупномасштабном же культивировании поддержание гомогенности культуральной среды становится одной нз главных проблем. Перемешнваннс культуральной среды влияет и на другие параметры: скорость переноса кислорода из пузырьков ц»за в жплкую среду, а затем из среды в клетки; эффективность теплопсрсдачи; точность измерения концентрации мстабсшнтов в культуральной жидкости; эффективность днспергнровання добавляемых реагентов (кислот, ос»юваннй, питательных»»е»»»ест»» н т. д.). Исходя нз всего этого, можно было бы предположить, что чем интенсивнее культура перемешивается, тем лучшс она растет.
Однако прн чрезмернол» псрсмсшнваннн среды в ней л»огут возникнуть гндромеханнческнс эффекты, губнтсльныс лля бактернальных клеток н клеток Поскольку кислород плохо распюрим в воде, рост азробных бактерий часто лимитируется количеством расгворенпого в культуральной среле кислорода. Эта проблел»а особенно ак»уальна при большой плотности куль»урн или при крупномасппабной »1»ерментации. Чтобы решить се, биотехнологи попытались увеличить количество кислорола, поступающс»о в жидкую куль»уральную среду.
Предложенные полходы сосго»ши в слелу»ощем: 1) подача а кулшуральоую среду чи»лого кислорода вместо воздуха; 2) подача воздуха (или кислорода) под давлением; 3) добавление к культуральной среде хими- таким образом, чтобь» он мо» более эффективно использовать тот кислород, который присутствует в культуральной среде. Они перенесли ген, кодирующий гемоглобиноподобное соединение, из грамотрицательной бактерии У»ггеозсИи зр. в несколько рекомбинаптных бактерий.
Бактериальный гемоглобин связывал кислорол среды и цодлерживал высокую концентрацию его в клетках, что стимулировало рост и экспрессию чужеролного белка. Этот полков проилл»острцровал возможность весьма нес'киданного биологического решения трудной технической задачи. 356 1 ЛАВА 16 млекопита!оших, или произойти повьппсние температуры, которое также скажется на их жизнеспособности.
Таким образом, как всегда, нужно соблкщать баланс между необходимостью тщательно перемешивать среду и стремлением сохранить цслостност ь клеток. Гсть еше олин аспект, касающийся крупномасштабной фсрментапии, который не имеет отношения к технической стороне процесса, а касается топя используются ли при этом рскомбипантные микрсюр!анизмы. В большинстве стран крупномасштабное культивирование рскомби!Сантных микрООргани5МОВ сопряжено с необходимостью соблюдения определенных правил и инструкций.
Хотя Гюльиинство рскомбинантных микроорганизмов не представлгпот никакой опасности. важно не допустить их случайного попадания в среду. Д.!я это! о используются надежные системы, предотвращающие утечку живых рскомбинантных организмов или ограничиваюп!Не их распространение, если утечка все жс п(юизошла. Кроме !ого, перед окончательным удалением из установки все рекомбинантныс микроорганизмы должнь! быть инактивировапы в соответствии с опрелсленныл!и инструкциями. Испол!Сюваннук1 кулшуральную среду тоже необходимо проверять на наличие в ней жизнеспособных мик1юорганизмов, чтобы пскл1очить их попа шние в окружакядую среду. Культуры с высокой плотностью Вообще !Оворя.
при получении чужеролных белков с помощью рекомбинантных Е со(1'руководствуются тем, по при максимальной конечной плотности культуры получается и максимальное количество продукта. В фсрментсрах периодического дсйс!Вия с добавлением субстрата концентрация рекомбинантных клеток Е со)!'достигает 50 !рамм сухого вещества на 1 л срслы (а в некоторых слу !аях >100 !./л). (Все сухого вещества клеток Е го)!' составляет примерно 20 — 25% веса влажного вещества.) Олин из способов повышения плотности культуры состоит в оптимизации культуральной среды. Следуе ! иметь в виду, что некоторые питательные вещества, в том числе источники углерода и азота, при слишком больших ко!Тцсит— раш!ях замедляют рост клеток.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
