Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 105
Текст из файла (страница 105)
ГЛК1коза подавляет рост при концентрации >50 г/л, ам- миак — при концентрации >3 г/л, жслезо— >1, 15 г/л, магний — >В,7 г/л, фосфор — > Гб г/л, цинк — >0,038 г/л. Таким образом, простое увеличение содержания питательных веществ в культуралыюй среде при периодической фсрмснтации нс даст желаемого результата. Кроме того, поскольку состав сложных сред типа пептона нли дрожжевого эксзракта может немного различаться от раза к разу, ферментация в них нс всегда бывает воспроизводимой.
Апетат, который можег подавлять рост клеток, продуцирустся Е. со)1' при росте в условиях нелостатка кислорода, но избьпка глюкозы. Проблему его образования можно решить, если использовать в качестве источника углерода глицерин вместо глюкозы, понизить температуру или использовать рекомбинантный штамм 11. С011, спОсОбный преврапяп ь аистят В мснсс тОксичные Вещества (см. !л. 6).
В культурах с ш !сОкой 1шОтнОс'1ыО МОжет также возникнуть недостаток кислорода. Чтобы избежать этого. увеличивают коли !Сство поступшощсго воздуха (разбрыз! иванне) либо скорость перемеишвания или делают и то, и дру!ос. Кроме того, можно подавать в культуру чистьш кислорол, а не воздух, в котором содержится только 20% кислОЛО1и, или вьйд!ЩиВать клетки ПОд ддвлснисм, чтобы увеличить растворимость кислорода. В качестве альтер пати вы предлагалось зксп ресс и рогапь в хозяйских клетках /:; со(!' ген гемоглобина Иг!еозс!7/а, по значительно увеличило бы поглощение кисло!юла растущими клетками.
Высокой плотности !аще всего удастся достичь при росте в периодическом рсжимс с добавлением субстраза. Режим полачи питательных веществ может быль разным: непрерывным, ступенчатым или экспонснциалы!ым. При непрерывном режиме в среду в течение всей ферментации вносят одинаковые количества питательных ве!цеста, Однако в этих условиях удельная скорость роста непрерывно снижается. При ступенчатом режиме питательныс ве!цества добавляют по мере увеличения концентрации кое ! ок во все болыпем коли1сстве, так что снижение удельной скорости росга в значительной мере компенсируется.
При экспоненциальном режиме питательные всп!сства добавлякзт в количестве, обсспечиванзщем постоянную скорость роста клеток. Периодическую палачу питательных Вс!Исств можно автоматизи- Промыщленпыи синтез белков при участии рекомбшщншых микроорганизхзоп 357 Биореактпры ~ газя 1ход газя ульзурзльняя среда ультурзльпяя среда !опзози Поляча яозлухз Подача воздуха д газа и сепаратор улыурадьпая среда узьтурзльпдя среда (епзрзяьняя ~рубя Н ясхолзгщяй пгпок Восхолязпяй поток Подача яоздухя Полдчя иилухя ровать, основываясь па результатах измерения концентрации лимитирующего субстрата (на- пример, гл1окозы) в среде в ходе ферментации. При беглом просмотре литературы цо биотехнологии создается впечатление, что число типов биореакторов безгранично. Однако на самом деле все биореакторы можно подразделить па три основных группы: реакторы с механическим персмсшиванием (рис.!6.4, А) барботажпыс колонны, через которые для перемешивания содержимого пропускается воздух или другой газ(рис.
)6.4, Ь) Рис. 1б.4. Разные типы биореакторов (упрощенная схема). А. Реактор с механическим перемешпяанием. Б. Барботажная колонна. И. Эрлифтный реактор с внутренней рециркуляцией. 7: Эрлифтный реактор с внешней системой рециркуляции. Стрелки — направление потока культуральной среды. зрлифтныс реакторы с внутренней (рнс. 16.4, В) или внешней (рис. 16.4, 1) рециркуляцисй; персмешивание и циркуляция культуральной среды в ннх обеспечивается потоком газа (обычно воздуха), за счет которого между верхним и нижним слоями культуральной среды возникает градиен~ плотности. Чаще всего используются биорсакторы первого типа.
Они обладают следующими преимуществами: позволяют легко менять технологические условия ° всегда есть в продаже ° обеспечивакп аффективную доставку газа к растущим клеткам (если говорить на инже- >58 ГЛАВА 16 нернол! языке, обладают высоким объел!Иыч коэффициентом массообмена, Ага) уже давно используются для выра!Иинания различных микроорганизмов.
В реакторах с механическим перемешинанисм газ (как правило, воздух) полают н культуральную срелу пол давлением через разбрызгиватель — кольцо с множеством маленьких отверстий либо трубку с одним отверстием. В первом случае образуются мелкие пузырьки воздуха и обеспечивается их более равномерное распрелсление, олнако разбрызгинатели в ниле трубок используются чаще, поскольку они реже закупоринаются. Для равномерного распределения газа по всему объем> биореактора используются мешалки —. олпа нли несколько. Они разби!3яют крупные пузырьки возяуха, разносят их по всему реактору и увеличивают время пребывания в культуральной срелс. При сильном перемен!ивании средний размер пузырьков в болыпих биореакторах практически пс зависит от размера отверстий н >зазбрызгивателе.
Эффективность распределения газа зависит прежде всего от типа мешалки, числа оборо- тО!3 и 13я!зико-химических с13ойстВ срс»ты. Есгш размер бпореактора слишком велик, а !Зз, поступающий из рязбрызгивателя, распределяется ПО Объсм> нера!3нол!срно, то лажс нри эне>!п1чнОм псрсмсп!иВанни Гол!Ого!и13иро13ать с)3СЛ>' нс уластс51. Многие культу(ззльныс срслы весьма агрессивны, и ВО пзбсжзнис корролиш!ОГО или мсхзнпчсского повреждения стенок биорсак гора его обышю из!озавлинак>т из нержавеющей стали нли стекла. Стеклянные части чщцс используют только н лабораторных биореакторах емкостью меньше 50 л.
Размер биорсакторя лпмитируется его способностью эффективно отдавать тепло, Выделяемое л!икроорганизмами в ходе метаболизма и высвобожласлюе в результате псрсмешивзния. Если теплоотлачя нелостаточна, температура среды может превысить кри гическую, что уменыпит выход пролукта. Для отнолз тепла пспользу!От охлажяающук! рубашку или змеевики, помсшас мыс Внут)зь рсактОря.
Вн у ! реннсс Охлажлснис более эффективно, однако змеевики часто покрываются слоем растущих клеток, что зя- трулняет охлаждение, а иногда мешает интенсивному псремешиванию культуральной среды. Большу!о опасность прелставляст загрязнение фсрментера грибами или бактериями. Поэзому биореакторы конструируют таким образом, чтобы их можно бьшо стерн>!3!зовзгь; обычно для этого используют пар под давлением. Вну!ри реактора не лолжгю быть «мертвых зон», недоступных лля пара но врсл!я стерилизации.
Обработке подлежат все клапаны, датчики, Входные и вь!холныс отверстия. При конструиронанпи перед инженерами зачастую возникает проблема: использован максимальное число датчиков лля полного контроля за процессом фермснтации или ограннчигься их минимвльныч набором „чтобы легче было по!!держивать стерильность. При интенсивном персмсшивзнии культу- ральной среды в процессе ферментации часто происхолит ее вспенинанис. Это может принести к переувлажнснию филыра н отверстии, чсрсз которое воздух выхолит из биореакторз, и уменыпению его потока, а также к попадани!о в реактор посторонних микрооргзн!3зл!о!3, Для контроля пенообразонания используют химические пеногасители или механические сбинатели пены. Однако н присутствии химических реагентов может ухудшаться перенос кислорода, а ипогла происходить ингибирование клеточных ферментов, что уменьшает скорость роста микроорганизмов.
Кроме того, если пеногасители не улалять, они могут загрязнять конечный продукт. Проблему вспснивзния можно решить, если оставить н верхней части биореакторалостаточно большое пустое пространство, в котороч лопались бы пузырьки воздуха. Правла, в этом случае рабочий обьем реактора умсньнппся примерно на 25%. Все эти соображения относятся и к «пнснчатичсским» рсактОрам '!ипа бзфютзжнь5х колОНН и эрлифгных биореакторон. Такич образом, обеспечение стерильности, постоянства рН и температуры — кл!Оченые требования при любом способе культивирования независимо от конструкции биорсзктора. Конструкционные особеп!юсти бзрботажных колонн и эрлифтных биорсакторон дают им некоторые преимущества персЛ реакторами с механическим псремешпванием. «Пневматические» реакторы более экономичны, поскольку Промышленный' сигпез белков при участии рекомбинантиых микроорганизмов 359 псрсмсшинанис в них происходит с помощью аосходяшсго потока воздуха (или другого газа в случае анаэробных микроорганизмов), а нс мсханичсской мешалки, потребляющей много энсргии.
Кроме топо, в отсутствие мсханичсской мегпалки исключается и один из путай проникновсния н биорсактор посторонних микроорганизмов. В пневматических биорсакторах в культуральной срсдс не нозникаст столь сильных гилродинамичсских возмушсний (сдвига слосв жидкоспг друг относитсльно друга), при этом н эрлифтных биорсакторах псрсмсшиванис происходит болсс равнолгсрно по всему объему. Умсньшсннс сдвиговых эффектов очень важно по слслующим причинам; клетки рскомбинагп ных микроорганизмов болсс хрупки, чсм нстрансформированныс клетки, поскольку часть их энсргстичсских ресурсов расходуется на синтез чужеродных бслков и в рсзультатс образусгся мснсс прочная клеточная стенка самый распространснный ответ клетки на внсшнсс возлсйствис — умсньшснис количсства вссх синтсзирусмых бслков, в том числе и рскомбинантных под дсйствисм сдвиговых эффсктов могут измсняться физичсскис и химические свойства клеток, что затруднит дальнейшую работу с ними.
Например„может унсличиться колнчсство полисахаридов на повсрхгюсти клеток, что привсдст к ухулшснию условий их выдслсния и лизиса, а также затрулнит очистку рскомбицантного белка. В барботажных колоннах воздух подается пол высоким ланлснисм в нижнюю часть биорсактора; по морс подыма маленькие пузырьки нозлуха объединяются, что приволи г к неравномсрнолгу сто распрсдслснию. Кроме того, подача воздуха под высоким лавлснисм может привести к слишком сильному пснообразонанию. Все это ограничиваст универсальность данных конструкций и сужает диапазон реализуемых тсхнологичсских условий, а также умсньшаст возможный размер барботажных колонн. Эрлифтныс биореакторы могут использоваться как в экспсримснтальных установках, так и в цслях промьпплсцной фсрмснтации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
