Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 108
Текст из файла (страница 108)
А поскольку клеточные стенки у разных микроорганизлюв состоят из разных полимеров, никакова универсального метода их разрушения нс существует. ° У >рамположительных бактерий клеточная стенка состоит из толсто> о псптилогликанового слоя )л)-аггет>о>гл>окозамина и остатков (л)-ацетилмурамовой кислоты, соединенных пегпидн ыми мости ками. У грамотрицательных бактерий клеточная стенка тоньше и покрыта снаружи слоем ли видов. ° Стенка дрожжевых клеток состоит из плотного слоя частично фосфорилированныл маннанов и !З-глюканов. Низшие грибы имеют многослойные клеточные стенки, состояп!ие из а- и р->зпоканов, глпкопротеидов и хитина.
Состав и прочность клеточной стенки зависят от условий культивирования, скорости роста клеток„фазы, на которой они собираются, условий хранения сконцентрированных клеток и от того, зкспрсссировал ли выделенный микроорганизм клонированный ген. Хил>ические металы разру>пения клеточных стенок включают обработку щелочью, органичсскилги растворителями или Лстергентами.
Если белковый пролукт нс разрушается»ри рН от 10,5 до 12,5, то можно без труда и лешево лизиравать балыпис количсс>ва бактериальных клеток. Например, рскомбинантный гарлюн раста человека очень просто выделить из клеток Е. со)1 обработкой >идроксидом натрия при рН ! 1. После обработки щелочью нс остается практи'>секи ни одной жизнеспособной клетки, чзи автоматически реп|аст проблему утечки рекомбинантных микроорганизмов. Обработка органическими растворителями — это простой и недорогой способ разруп>ения клеток, который ис>юльзустся для выделения ферментов из г[рожжсй.
Однако, чтОбы убедиться в том, что в подобранных условиях белковый продукт не дснатурируст, необходимо провести предварительное тестирование. Пад действием дстергентов в мембранах бактериальных клеток образуются поры, через которые белки и другие молекулы выходят из клетки. 1л сожалению, лстергснты дороги, в болыпинстве случаев в их присутствии белки денатурируюг, в кроме того, они могут загрязнять конечный продукт. Основным биологическил> моголам разрушения клеток микроорганизмов является лизис с помощью ферментов.
Так, лизоцим яично>а белка легко >парализует клеточные стенки грамположительпых бактерий. Для разрушения клеточных стенок грамотрицазсльных бактерий используют лизоцим и этилсндиаминзстрауксусную кислоту (ЭДТЛ), а клеточные стенки дрожжей гидролизуют с помощью одного или Збб ГЛЛВЛ 16 нескольких ферментов: 1)-1,3-глюканазы, 1)-1,6- »люканазы, манназы и хнтиназы. Фсрментативная обработка высокоспсцифичпа, а лизис прохолит в мягких условиях. Пока использование ферментов для лизиса клеток сдерживается их высокой стоимостью, но с применением рскомбинантных микрооргапизьюв для промышленного синтеза ферментов, разрушающих клеточ»»ыс стенки, эта»»роблсма будет решена. Клетки можно разрушить и физическими мстолами: немеханичсскнми (напримср, с помощью осмотическо»о шока или быстрого многократного замораживания и оттаивания) или механическими (обработкой ультразвуком, с помощью п»аровой мельницы, гомогенизации пол лавлением, соуларения). Обычно после обработки нсмеханичсскими метолами многие клетки остаются неповрежденными.
Напротив, механическое разрушение высоко- эффективно, что делает его более привлекательным. Особенно часто ультразвуковые излучатели, генерирующие высокочастотные звуковыс волны, используют лля обработки малых объемов. Клетки разрушаются при этом под лсйствисм гидропинамичсскнх сил (сявига слоев жидкости друг относительно друга, кавитации и т. л.). Для разрушения большою количества клеток обычно используют шаровые мельницы. Концентрированную клеточную суспензию заливают и камеру высокоскоростной шаровой мельницы, заполненную инертным абразивным материалом (например, стекзяннь»ми шариками диаметром <1 мм).
Солержимое быстро перемешивают с помощью лопастей, насаженных на ось. Большинство клеток разрушается пол лсйствием сдвиговых напряжений, возникающих в результате быстрого движения шариков. Условия оптимального разрушения клеток можно полобратьз варьируя число и форму лопастей, скорость псремешивания, размер шариков„их число, концентрацию клеток, геометрию камеры и тем»»еразуру.
Приборы такого типа успешно использовались лля разрушения клеток самых разных микроорганизмов. С их помощью можно легко разрушать клетки как псрскомбинантных, так и рскомбинантных микроорганизмов. При гомогенизации пол высоким лаилснисм конце»прированную клеточную суспензию продавливают через небольшое отверстие под высоким давлением, а затем лавлсние резко сбрасывают, что и вызывает лизис. Условия обработки можно оптимизировать применительно к разным микроорганизмам.
Для этого изменяют рабочее давление, размер и форму отверстия, температуру клеточной суспснзии, число пролавливаний. Е»це один механический метол разрушения клеток — соуларенис. Клеточную суспензию болыпой вязкости направляют пол лавлснием на неполвижную поверхность или навстречу потоку лругой суспснзии. В месте соприкосновения иылеляется большое количество энергии, разрушающей клетки. Таким способом с помощью устройства пол названием Мгсгойш»йясг за олин прием была разрушена ббльшая часть клеток Е. сой и двух встречных потоках суспснзии.
Олнако лля разрушения клеток лругих микроорганизмов может понадобиться большее число раундов. В отличие от гол»огенизаторов пол высоким давлением и высокоскоростных шаровых мельниц, в которых, как правило, используются концентрированныс клеточные суспензии, ланное устройство пригодно лля обработки любых суспензий. Как»»оказал»» предварительные исслелования, активность клето шых белков уменыпастся при разрушении клеток по этой методике лишь незначительно.
А сели обработать суспензию клеток нсбольшил» количеством лизоцима, а затем использовать устройство М(сто()ш»11иег в режиме пониженного по сравнению с обычным давления и при небольшой вязкости, то сохранится активность некоторых лабильных белков, инактивируюшихся при высоком лавленни. Дальнейшая обработка После разрушения клеток их осколки удаляют либо низкоскоростным центрифуп»рованисм болыпих объемов, либо микрофнлырацией через мембрану. Белковый продукт осаждают из грубого или осиетленного лизата органическими растворителями (спиртом или ацетоном) или сульфатом аммония.
Достигаемое при этом обогащение — 2 — 5 раз. К сожалению, дороговизна Промышленный сппзез белков при участия рекомбинантных микроорганизмов 367 агентов, использующихся для осаждения, может значительно увеличить стоимость процесса. В качестве алы.ернативы для концентрирования и выделения суммарных белков можно использовать ультрафильтрацню с параллельным потоком через мембраны с меньшим срслним размером пор, чем у мембран, применяющихся для концентрации клеток или удаления их осколков (рис. 16.7, Ь). Этот полхол пока 1~аходится в стадии разрабагки, однако уже ясно, что он пригоден для работы с объемами от одного до нескольких тысяч литров, процесс может идти непрерывно (что позволяет уменьшить размеры установки) и обеспечивать Н) — 100-кратное обогащение (в зависимости от размеров и свойств выделяемою белка).
Необходимая степень очистки белкового продукта зависит от того, где сто намереваются использовать. В олних случаях это может быть довольно грубый препарат, в других (например, сели речь идет о белках, использующихся в мелицинс) — препарат высокой степени чистоты.
Нскоторыс белки, синтезирующисся в клетках в избыточном количестве. образуют нерастворимые частицы (тельца включения). После разрушения клеток их легко можно отделить от большинства других клеточных компонентов. Вначале исследователям не удавалось лезагрегировать выпелснные тельца включения так, чтобы при этом нс произошла необратимая денатурация белков, по позже были разработаны метолы, позволяющие рснатурировать рекомбинантный белок и восстановить его актив|юсть. Ясно, 'гго все эти дополнительныс процедуры увеличивают стоимость процесса очистки. Солюбилизпиия белков В некоторых случаях при гипсрпродукции рскомбинагггных белков образуются как растворимыс, так и нерастворилгые продукты, что усложняет процедуру очистки. Например, при экспрессии в клетках Е.
со!1 гена инсулиноподобного фактора роста 1 (! СГ-1) человека мол. массой 7,6 кДа примерно 90% рскомбинаптных молекул локализуется в псриплазме, а 10% секрстируется. Чтобы выделить расгворимую и нерастворимую формы 1СГ-1 из периплазмы, лля солюбилизации нерастворимой формы !и з!гц добавляли мочсвину и дитиотрейтол до высоких концентраций при щелочном рН. При этом клетки погибали, но нс разрушались, так что цитоплазматичсские белки оставались внутри клеток. В рсзулыатс образовгявался очень вязкий раствор, что затрудняло осаждсние клеток и их осколков центрифугированием.
Чтобы решись эту проблему, разработали процедуру двухфазной жидкостной экстракции, позволяюгцую разделять растворимые и нерастворимые пролукгы. И солюбилизация гп зйц, и двухфазная жидкостная экстракция высокоэффективны; с их помощью можно вьщелить от 80 до 95% ! ()Б-1 из культуры объемом от 10 ло 1000 л. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Для крупномасштабного культивирования рекомбинантных микроорганизмов в промышленных биореакторах (>!000 л) недостаточно просто экстраполировать условия роста в лабораторных ферментсрах (0,1 — 1,0 л).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
