Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 110
Текст из файла (страница 110)
Как влияет присутствие в клетке рекомбина~тной плазмиды на ее рост? 4. Как влияет перемешивание на доставку кислорода из культуральной среды к клеткам? 5. Для чего нужно стремиться максимально повысить плотность культуры при промышленной ферментации? 6. Каковы относительные преимушества и недостатки биореакторов с механическим перемешиванием и эрлифтных биореакторов? 7. Сравните процедуры выращивания и индукции культуры рекомбинантных микрооршнизмов в двух тандемных биореакторах и в одном реакторе. 8. Какой обработке подвергают клеточную суспензию по завершении ферментации? 9. Какую стратегию вь1 бы выбрали для очистки рекомбинантного белка, секретируемого в культуральную среду? 16. Каковы преимущества и недостатки механического разрушения клеток по сравнению с химическим? 11.
Как собирают клетки по завершении ферментации? Каковы преимущества и недостатки соответствукпцих методов? ЭУКЕРИОТИЧССКИС СИСТЕМЫ о недавнего времени высокопродуктивные сорта сельскохозяйственных растений и новые породы животных получали методом сслекции. Однако этот подход, требующий для своей реализации много времени, уступил место методам, основанным на гснной инжснерии высших организмов. Теперь гены, обусловливающие специфичсские признаки, могут вводиться в клетки растсний или животных и передаваться следующим поколсниям (наслсдоваться). В ч. 1П мы рассмотрим, как получаются такие трансгснныс растения и животные. Уже создано несколько видов трансгснных растсний, обладающих признаками, которые дстсрминируются генами, введснными в них ~снноинженерными методами. К числу таких признаков относятся: способность синтезировать инсектициды; устойчивость к вирусным инфскциям и гербицидам; изменснные сроки созревания плодов; измененная окраска цветков; повышенная пищсвая ценность семян и самонссовмсстимость.
Исследования трансгсноза у животных только начинаются„так что пока трудно прсдсказать, какие генетичсскис признаки будут наследоваться видом-реципиентом. К настоящему времени выведены линии трансгенных мышсй, которые используются как модельныс системы для изучения механизма возникновения рака, муковисцидоза, болезни Альцгсймера и других заболеваний человека.
Тсхнология рскомбинантных ДНК нашла широкос применение в изучении наследствснных болезней чсловека и раз- работке методов генной терапии. Так, используя специфический хромосомный сайт в качестве маркера, можно локализовать на хромосоме человека ген, ассоциированный с данным заболеванием, ничего не зная о механизме действия этого гена, а затем, используя клонированную последовательность, которая узнает этот маркерный сайз; попытаться идентифицировать дефектный ген. С помошыо такого подхода уже были найдены и охарактеризованы гены некоторых болезней человека.
Далее можно исследовать механизм действия нормального и дефектного генов и разработать эффективныс методы лечения. В ч. Ш обсуждиотся молекулярная генетика человека и генная терапия. ГЛАНА 17 Генная инженерия растений: методология Трансформация растений Т1-ндазмидой из АдкоЬасРепит аяте~асгепа Одной из основных задач селекционеров было получение высокоурожайнгах сортов растппзй с повышенной пищевой ценностью. Наибольшее внимание уделялось при этом таким зерновым кулыурам, как кукуруза, пшеница и рис, однако были осуществлены программы и по скрещиваншо других сельскохозяйственных и садовых культур.
В качестве важного инструмента прямого генетического воздействия на растения применяется технология рекомбинантных ДНК, широко использующаяся в микробиологических системах. К пастошпему времени разработано несколько эффективных систем переноса ДН К и экспрсссируклпих векторов, которые работают в ряде растительных клеток. Одним из достоинств последних является их тозипотентностгя из одной клетки может быть регенерировано целое растение, так что из югеток, сконструированных гешюинжснсрными методами, можно получить фертильные растения, все клетки которых несуг чужеродный(е) ген(ы) (транс~сивые расгения).
Если такое растение цветет и дает жизнеспособнгяе семена, то желаемый признак передается последующим поколениям. Можно привести три основных аргумента в пользу получения трансгенных растений. Вопервых, введение гена (генов) часто приводит к повышению сельскохозяйственной ценности и декоративных качесзв культурных растений. Во-вторых, трансгенные растения могут служить живыми биореакторами при малозатратном производстве экономически важных белков или метаболитов. В-третьих, генетическая трансформация растений (трансзсноз) позволяет изучать действие генов в ходе развития растения и других биологических процессов. Некоторые генетически обусловленныс признаки — такие как инсектицидная акт.ивностгч устой ~ивость к вирусным заболеваниям и гсрбицидам, замедление старения, устойчивость к неблагоприятным условиям окружающей среды, измененная окраска пвстков, повышенная пищевая ценность семян и самонесовместимость — могут быть приобретены растением при введении в него одного или нескольких гснов.
На сегодняшний день уже получены многочисленные трансгенные растения на основе как культурных, так и диких видов. биотехнология несомненно внесет коррективы в традиционные программы разведения растений, в рамках которых для выведения ново~ о сорта требуется от 1О до 15 лет.
А в будущем с ее помощью можно будет создавать растения с совершенно новыми характеристиками. Грамотрицательная почвенная бактерия АагоЬаггеиит гагле~пс1елз — фитопатоген, который в процессе своего жизненного никла трансформирует клетки растений.
Эта трансформация приводит к образованию корончатого галзш— опухоли, нарушающей нормальный рост растения (рис. 17.1). Эгей болезни, имеющей серьезные агрономические последствия„подвержены только двудольпые растения, в частности виноград, косточковые фруктовые деревья, розы. Образование корончатого юлла начинается с проникновения, инте~ рации в геном растительных клеток и экспрессии спепифического сегмента бактериальной плазмидной ДИК вЂ” так 374 ГЛАВА 17 ннс жасннс агыя галл о сн т-днк ц сн о ОН Австоснрингон о снон Ка»аболнзи пина оп' сн о ОСНз ОН Гндроксиапстоснрншон Корни ) »е» с» с»с»с с» с» ~ лоос, с д гиве)асГепг Рнс. 17.1.
Инфицированнс расгсннй А. гитерас(епз и об- разование корончатого галла. называемой Т-ДНК (от англ. (гапх2сггег( 2))»А). Т-ДНК вЂ” это часть плазмиды„инлуцирующей развитие опухоли ((шпог-(пдцсп~ р1авпчЫ, Т1-нлазмиды); ее несут большинство штаммов А. (итегаасчепж Рнс.
17.2. Структурные формулы ацетоснрннгона н г ндрокснацечоснрннгона. Эш соединения выделяются растением в ответ на поврежленне н активируют ь(г-гены Трплачмнды. Длина Т-ДИК варьирует от ! 2 до 24 т. п. и. в зависимости от шчамма. Штаммы А. гитерас(е»пгь не содержачцие Т1-плазмиды, не способны индуцировать развитие корончатого галла. Инфекционный пропесс начинается с прикрепления А. (илге(ас(епх к клеткам растения в месте повреждения, часто у основания стебля (у корневой шейки). Ранее предполагалось, ччо А. (игле)аг(епх заражает именно поврежденные растения вследствие разрушения клеточной стенки и устранения физического барьера, затрудняющего проникновение бактерий в клетку. Однако сейчас считается. что все дело в специфических фенольных сов чинениях.
апетосирингоне и гнлроксиацетоснрингоне (рис. 17.2), которые выделяет поврежденное растение. Эти соединения сходны с некоторыми продуктамн основного пути синтеза у растений вторичных метаболитов, таких как лигнины и флавоноиды. Ацечосиринчон н гидроксиацечосиришон активируют гены вирулентпостн (Иг), которые локализованы в участке Т(-плазмиды длиной 35 т. п. н., находящемся за пределами Т-ДИК. Продукты г(ггенов необходимы для транспорта и интеграции Т-ДНК (рис.
17.3) в геном растительной клетки. Существукчт по меньшей мере семь разных Иггенов. Рнс. 17.3. Генетическая карта Т(-плазмнды (ыасцпаб не соблюден). Т-ДНК содержит гены аукснна, цнтокнннна н апина, которые транскрнбнруются н чранслнруются только в расппельных кчетках За прсдсламн Т-ДНК паходнчся кластер»агнецов, ген(ы), кодирующий(е) фсрмент[ы) квтаболнзма олина, н сад г нннциапнн репликацнн (оп), который обеспечивает стабильное поддержание гпачмнды в А.
ьееч(кусая Л н П вЂ” левая и праввл фланкирующие последоввгсльностн соогвсгствснно. Генная инженерия растений: метсгаолоп~я 375 НН ! СН,— СН вЂ” С вЂ” ОН !! О О Ъ О + СНз — С вЂ” ННз СО,,::, ',:-'-' .':: '.::1 О НО !! СН вЂ” С вЂ” ОН Индолвл-3-апетамид ЙН, .':,.1ъ:- .т:1 Нн Трнптсфан Индслвлуксусная кислота НН О !! Π— Р— О— ! О О !! СН, Р— Π— СНз — СН = С + СН О Изопентиллифссфат ОН ОН 5'-АМР СНз ХН вЂ” СНз — СН = С СНз ') ОН ОН Изопентнладенозинмонофос4кп Рис.
37.4. Биосинтез ауксина и цюгакинина при участии ферментов, кодируемыл генами Т-ДИК 33-плазмиды А. гиглегисылз. А. Синтез ауксина начинается с превращения трнптофана в индолил-3-ацетамид, катализируемого триптофанмоноокспгеназой. Затем происходит превращение индолил-3-ацетамида в индолилуксусную кислоту ферментом индолил-3-ацетамидгидролазой. Б. Синтез цитокинина включает присоединение изопентенильной группы изопентенилднфосфата к 5'-АМР прн участии фермента изопентенилтрансферазы с образованием изопегггенилаленозинмонофосфага. 376 ГЛАВА 17 После присоеди~ ~еььия А. (итеХасьеььз, несущей Ть-плазмиду, к растительной клетке и активации лтгецов Т-ДНК транспортируется в клетку,по-видимому,с помощью механизма,аналогичного механизму переноса плазмидной ДНК из донорной клетки в реципиентную в пропессе конъьогации. При этом Т-ДНК находится в одноцепочечной форме, и именно в такой форме она встраивается в хромосомцую Д Н К растения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
