Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 113
Текст из файла (страница 113)
В связи с этим лучше не вводить гены устойчивости к антибиотикам в сельскохозяйственные рзстения. Некоторые продукты репортерных генов (нзпример, р-0-глюкуронидззу, з также люциФеразу, синтезируемук> бактериями и светляками) можно обнаружить в иптзктцых рзстительпых тканях. В системах трзнсформзции чаще всего используется ген ))-Е)-глкукуронидззы Е. сон (ОгОЯ-ген). Он кодирует стабильный фермент, обычно отсугству!оший в растениях„которь!й кзтзлизирует рзс!це пление )у- Г)-глюкуронидов. Его активность в трзпсформировзнных растительных тканях можно обнаружить по появлению синей окраски в результзте гидролизз неокрашенного субстрзтз, 5-бром-4-хлор-3-индолил-11-0-глюкуроновой кислоты. Альгернзтивный, Гюлее чувствительный метод количественной оценки зктивности О () Б-генов в растительных экстрзктзх осногззн нз определении интенсивности флуорсспенции продукта гидролизз 4-метилумбеллиферил -)3- Гу-глюкурон идз. Дя Дв Дя Дя Дя Нет 11ет Нег Дя Дя Нет 1! ст Дя Дя Дя Дя Нег Дя Дя Дв Дя Дз Дя Дя Дя Дя Дв Дз Дя Нет Дя Дв Дв Дя Нет Дя Дя Дя 11ет Нет Генная инженерии растений: методология 383 ° ° Регенерация жизнеспособных фертильных растений, синтезирующих октопинсинтазу, из корончатого галла табака после делении генов, контролирующих образование опухоли Н.
Ое Огата, 1. !.еспзапа, 3. Р. Негпа!пеева, К Тй!а-тоопй, М. Гзе Вацеке!еег, 1. Ъу!1!ш!!хе!, ! . Опеп, М. Ъ'ап Моп!айц, 3. Бс!зей Лайке 300: 752 — 755„!982 росту растения. Поэтому прежде чем испольювать Т1-плазмиду в качестве вектора лля трансформации растений, необходимо прелотвраззпь образование опухоли. Изучая мРНК, транскрибирусмые с интакзных и модифицированных Т-ДНК, Пзслл и др.
показали, что гены„отвсгсгасннь1е за развю не корончат ого галла, локали:юваны в Т-ДНК. Это означало, что можно удалить из Т-ДНК эги гены и ввести ес с помощью гомешогичной рекомбинации в Тйплазмнау, а последнюю — а раститспьныс клетки. встроена в хромосомную ДНК„и рекомбнпантный белок будет импортироваться в соответствующую органеллу. Второй способ предполагает встраивание гена, кодиругощего чужеродный белок, непосредственно в хлоропластнук> или митохондриальную ДНК.
пользовали промотор гена малой субьеднннцы фотосинтетического фермента рибулозобисфосфат-карбоксилазы, работающего только в фотосинтезирующих тканях, например в листьях. Аналогично для контроля экспрессии некоторых чужеродных генов использовали растительные ! !ромоторы, функционирующие только в специфических тканях илн только прн неблагоприятных условиях. Подавляющее большинство генов растении локализованы в ядерной ДНК, однако хлоропласты и митохондрии тоже содержат гены, кодирующие ряд важных и уникальных функций.
При этом не все белки, присутствующие в этих органсллах, закодированы в их ДНК. Некоторыс из них кодируются ядерной ДНК, синтезируются в цитоплазме, л затем с помо!цью специального механизма импортируются в соответствук~щу!о органеллу. Есть два способа введения специфического чужеродного белка в митохондрии нли хлоропласты. Один способ -- это слияние гена, коднрукнпего чужеродный белок, и последовательности си)- пального цецтида, направляющего белки в органеллы. Такая конструкция может быть Вл!деление различи!ах прологпоров и их использование Для выделения растительных цромоторов нз некоторых видов растений использовали специализированные так называемые енромоторнаправленныс» векторы и систему трансформации на основе Т!-плазмил Аройгзсгепиаь Суть подхода состоит в следующем.
Репортерный ген без промотора встраивают сразу за правой фланкирующей последовательностью вектора на основе Т!-плазмнды, н после переноса Т-ДНК в хромосому растения он оказывается в окружении растительной ДНК. Если ТДНК встроится а промоторный у !асток функпионального гена, то произойдет транскрипция репортерного гена.
Для идентификации растительных промоторов в качестве репортерного гена можно использовать геп Для получения трансгснных растений необходима эффективная векторная система. Первые попытки созлания таких систем основывались на использовании Г1- плазмилы почвенной бакзерии л. гиепеГас!сия поскольку после инфицирования чувствительных лвудольных растений часть Ты нлазмиды (Т-ДНК) встраивается непосредственно в хромосомную ДНК клезки растения-реципиента.
Однако при инфицировании растений Т1-плазмизой на трансформированныхх растениях образуется корончатый галл — опухоль, препятствующая нормальному Т1-плазмила, включившись в хромосомную ДНК обы ~ным способом, перенесет и свою Т-ДНК, которая теперь не несет генов корончатого галла. Следующим логическим шагом а развитии этой системы стало клонирование чужеродною марксрного гена и гена, интерссуюикто исслсловатсля, в Т-ДНК, чтобы их можно бьшо транспортировать в хромосомную ДН К растения-хозяина. Векгорная система на основе Т1-плазмил нашла широкое применение во всем мире.
Ее используют для создания трансгенных растений в тысячах лабораторий. 384 ГЛАВА 17 Ввес)вине чуэкероду(ых генов в хлойолуувстиУ(о ДНК У большинства высших растений в каждой ктетке листа присутствует примерно 100 хлороиластов и каждый хлороилгзст содержит иримерио 100 копий хлороиластной ДН К. Для стабильной генетической трансформации хлороупастов с целью изменения их функциональных характеристик необхолимо вволить чужсролные гены в хлороиластную, а не в хромосомную ДНК.
длина которой примерно в 104 — 105 раз больше. Кроме того, необходимо, чтобы чужеролные гены присутствовали во всех из примерно 104 молекул хлоропластной ДНК, содержащихся в одной клетке. Тпблилп!75 Тестирование иромггторных коысзрукинй птрансгснных растениях' "1 Срелппй уровень экспрессии гена Расгеппе Максвапиыапй уровень эьспресенп гена 35$-промотор сложный промытой 355-промсоор сложный прамотор Табак Рпс 1.0 1,0 2,8 14,4 2,8 18,3 47,1 из расюп ~ м1гьггьагя я! а1.. Рулях сер Рьумкй 37: 49- 39, 1996.
М В хячеегве репоргернаго гена нспоеьзояалгг ген й гяюку1юннлазн Е. гой Фсрмснтхтнвпую актнаносп нормпрояа ю па срслнсму значению лля рясгення, кагла ген нахолнг ся пол контролем Мчз-промото1м. Фактн ~ескнс яелнчнньх напученно. прн ысгвраванггн пя юбякс, прнмерно в 36 раз прехнпоаяп тс. которые получены на росс. Слагкнын пгомоюр включал 358-прап«пор, сыпал и:рмннепнн транскрнппнн гс~ь попатннсюгглзы, семь танлемньы помарав зпхансерннх з|енснтов н Г1-послславательнасть ЛИК внруся габачнан маынкн. Срелпнн уровень мспресснн генов- моор«Лясс гггггчсг гге, пояучеююе попанннмаля носко»ькнх гранюенных Гхк~сгчигт, а максньыхьнып уьювень — ыо нанбольюсс. зааченне, пабяюлявыесся ня хггкам-абгг Ргстенгггг с мыпым промогорам.
неомииинфосфотрансферазы (лрО. При этом эксирессию данного гена можно ирокошролировать отбором канамицинустойчивых трансформантов. Однако таким способом трудно иЛеитифицировать иромоторы, функционирующие лишь на определенной стадии развития растения или индуцирусмые сиецифичсским фактором окружающей срелы. Чтобы быть уверенным в отборе именно трансформированных клеток, а Т-Е1НК следом за реиортерным 1еиом без 1громотора встраивают геи ус1ойчивости к пиромииину„нахолящглйся иол контролелт конститутивного иромотора. Сначала отбирают гш— ромицинустойчивые клетки„а затем проверяют фермснтативную активность трансформаитов в условиях, обеспечивающих экспрессию реиортсрног-о гена.
В результате обнаруживается, что от 5 до 30уо трансформированных растительных клеток несут реиортерный ген, находящийся иод контролем активного иромотора. 35В-иромотор вируса мозаики цветной капусты часто используют в расэительныл системах как сильный иромотор, хотя уровень экспрессии контролируемого им гена, кодируюшего чужеродный белок, часто оказывается ниже, чем хотелось бы. Чтобы решить эту проблему и найти наиболее эффективный промотор, необходимо протестировать в растениях различные конструкции «иромотор — гена.
Кроме промотора, экспрессию чужеродных генов могут усиливать некоторые лру1ие элементы, в частности энхансерные иоследовательности, расположенные на расстоянии от одной до нескольких сотен нуклеотидов ло иромотора, иитроны, стабилизирующие мРНК, и сигналы терминации транскршщии. Были 17ротестированы ДНК-конструкции„содержащие все или некоторые из следующих элементов: 355-ироыотор; сигнал терминации транскрипции гена ноиалинсинтазы; от олного до семи тандем ных повторов эихансерных элементов; так называемаЯ 82-иослелователы1остгч котоРаЯ пРециоложитсльио усиливает экспрессию гена на уровне трансляции.
Наиболее эффективная конструкция содержала семь эн хансерных элементов, ири этом уровень экспрессии чужсролного гена в трансгениых растениях табака и риса был намного вьцле, чем в случае одного 355-г~ромотора 1табл. 17.5). Протестированные иромоторные конструкции контролировали экспрессию в трансгеиных растениях широкого круга чужеролных генов. Такое разнообразие, вероятно. объясняется тем, что Т-ДНК встраивалась в разные сайты в геноме растения. Исиользуя этот подход, можно создавать сильные тканесиецифичныс иромоторы, регулируемые в процессе развития. Рис. л7.7. Плазмилные векторы, используе- мые зыя введения танлемных гснав в хлара- властную ДИК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
