Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 117
Текст из файла (страница 117)
Семена нигны китайскои, содержащие указанное ньиве количество ингибитора, нетоксичны для животных и человека. Впрочем, сели бы такая опасность и существовала, можно бьшо бы ограничить экспрессикг гена ингибитора теми тканями растения, которыми предпочитают питаться основные насекомые-нрсдители, но которые не используют в пищу человек и животные. Так, клонированный ген ингибитора протсиназ мог бы «работать» н листьях и корнях растения, но не в его плодах.
Введение гена ингибитора П протеиназы картофеля в растения риса защищает их от розового стеблевого точильщика (аегалиа гаГегеггх), основного насекомого-вредителя для этой культуры; заражение приводит к образованию полых стеблей и мертвых метелок без семян. Была сконструирована плазмида, содержащая ген ингибитора П протснназы картофеля под контролем его собственного промотора и сигнала терлгинаггии транскрипции. Между промотором и кодирующей областью гспа ингибитора был 394 ГХ!АВА 18 Рис. 183. 11лазмидиый вектор, несущий ~си иигиби гора И протеипазы картофеля.
Обозначения: Р!л2 — геп иигибюора !1 прозеииазы картофеля; 5'-коиец — сегмент ДНК, прещаесгвующий лаипому гену; 3'-колец — сепюгг ДНК„слелующий за геном; иитрон Асг) — первый иитрои гепа актипа 1 риса; 358 5'-коиец — 358-промотор вируса мозаики цветнои капусты; Ьаг — бактсриальиый ген фосфииогриции-ацетилтрансферазы; лгм 3'-конец — сегмент Д1-!К, следующий за геном нопалипсишазы.
1 ен Ьаг служит селективным маркером для трапсгеиных растений, обусловливая устойчивость к гербициду Вайа (глюфози нату аммония). встроен первый интрон гена актипа риса. Эту конструкцию ввели в суспендированныс клетки рцса мстолом бомбардировки микрочастицами (рис. 18.3) и регснсрировали из них трансгснныс растения. Когда личинок розового стсблевого точилыпика наносили на полученные таким образом растения, только от 15 до 20% последних оказывались поврежлснпыми, в то время как для растений дикого типа эта всличина составляла 70-100%. Г1оскольку растительцыс ингибиторы протеиназ являются обы шыми компонентами рациона человека и животных и в процессе приготовления пищи быстро инактивируются, их введение в новыс зсрновыс кульгуры можно считать безопасным. Дру!ой подход к увеличению эффективности защиты растений с помощью токсина В. Яиплдгеп.гй основан на параллетьном использовании этого токсина и ингибитора ссрнповой прогсиназы.
Показано, что смесь очищенного токсина В. йиплреимз в количестве, обеспечивающем минимальную смертносгь пасскомьгс, и ингибитора протеицаз в низких концентрациях обладает в 20 раз большей ицсектицидной активностью, чем один протоксгя! В. йиплр!епзгк Чтобы проверить, будет ли эта системаа ф)з ~кционировать в трансгенных растениях, бьп сконструирован фрагмент ДН К, кодируя>п!ий гибридный белок «ингибитор протеиназ/укороченный токсин». Траисгенныс растения табака, которые синтезировали небольшие количес!ва такого рекомбинантного белка, были в значительной мере защищены ог насекомых-вредителей. Е!цс один способ защиты растений прслполагаст введение в них гена, кодирукяцсго ингибитор а-амилазы.
Большой ущерб зерновым приносят такис насекомые, как зсрновка (Са!!озобгисlтих таси!ашз) и долгоносик лучистой фасоли (С. сИпелз!з), пита!о!циеся семенами. Если в рацион личинок этих насекомых включить обыч! !укз фасоль (РЬйжео!из вя!8сгй), то рост насекомых замедляется. Это связано с присутствием в семенах обычной фасоли ингибитора гг-амилазы.
Ген ингибитора а-амилазы, выделенный из обычной фасоли, был помеп!ен под траискрипциоппый контроль сильного семяспсцифичного промотора гена фитогсма! глкг ивина бобов и использован для трансформации гороха (Риит за!иит)„обычно весьма чувствительного к упомянутым выше насекомым. Трансгспные растения гороха, которые синтезировали ингибитор гг-амилазы, были усгойчивы к обоим насекомым, при этом в случас зсрновки эффект оказался пропорциональным количеству ингибитора, синтезированному растением (рис.
18.4). Лльшрнативный подход к выведению трапсгспных растений, устойчивых к насекомым, основан на г!спользовании бактериального гена холестсролоксидазы. Этот фермент, синтсзируемый различпьгми бактериями, катализируст окисление 3-гидроксис героилов с образованием кстостероилов и псроксила водорола. Его часто используют при определении уровня холестсрола в сыворотке крови у человека, а в небольших количествах он проявляет высокую инссктицидную активность против личинок хлопкового долгопосика (АпГлопотиз 8гттЖг хгалг)!з) (рис. 18.5). Это широко распространенное насеколше отряда жесткокрылых наносит ощутимый угцсрб хлопковым плантациям. В отношении насекомых-вредителей отряда чсшускрылых холестсролоксидаза менее эфФективна.
Действие фермента, по-випимому, заключается в разрушении мембраны эпитслиальных кчсток средней кишки насекомого, что приводит к его гибели. Ген ВО Гл о 40 20 О О 0.2 0,4 О,б О,В 1,0 Ксяпсятраяяя яягябятсря и-ам!ялазм, % сг асса семени !00 СЯ 60 40 20 0 0 холсстеролоксилазы, кодирующий белок мол.
массой 55 000 Да (504 аминокислотных остатка) и лилсрпый пептид ыол. массой 5000 Да (43 аминокислотных остатка), был выделен из штамма .9ггерготусез и встроен в вектор вместе с промотором вируса мозаики норичника щишковатого и сигналом тсрминации из 3'-области гена нопалипснптазы Л. Гите!ос!слз. Когда такую конструкцию ввели и протопласты клеток табака, трансформированные клетки стащи активно экспрессировать холестеролоксидазу. В будущем, вероятно, жгот ген будет введен и растения хлопка, и тогда — либо самостоятельно, либо и комбинации с генами других биологических инсектицилов— он станет эффективным инструментом защгпы растений от насекомых-вреянтелсй.
Рис. 18.4. Зависимость смертности личинок зсрноскя, разливающихся на трансгсиных растениях гороха, ст колпчсстаа ингибитора и-амияазы, синтсзируемого рагпениями. Рис. 18.5. Зависимость смертности личинок хлопкового лолгоносика о! концентрации холсстерояоксилазы. (СогЬ(с е! а(., Аррй Елг!гсл. МгсгоЫсс 60: 4239 — 4244, ! 994.) Генная инженерия растении: применение 395 10 20 30 40 50 бО 70 Ксяцсягрсяяя хслсстсрсясксгыазы, и. л. Рпгп!ения, устойчивые к вирусам Вирусы растений часто прнчиняк!т значительный ущерб растениям и существе!ню снижают урожай. Чтобы не прибегать к обработке культур химическими препаратами, сслскционсры попытались перенести природные гены устойчивости к вирусам от одной линии растений к другой.
Однако устойчивыс растения часто вновь СТОНОНЯТСЯ с1УВСТВНТСЛЫ1ЫМИ, а УСТОЙ'!ИВОСТ! К олпому вирусу нс гарантирует устойчивости к лругим. Природный иммунитет к вирусным инфекциям обусловливается разными причинами: блокированием проникновения вируса в растснис, прслотвращснием его распространения, подавлением симптомов вирусной инфекции. 39б ГЛДВД ГВ Чтобы получить растения, устойчивыс к вирусам, проводили их «иммунизапикз» вирусными генами, кодирующими белки оболочки, другими вирусными генами или антисмысловыми последовательностями вирусного генома.
Если в трансгснном растении экспрсссируется ген, кодирующий белок оболочки вируса, который обычно инфицирует это растение (а данный белок зачастую является основным белковым компонентом вируса), то способность вируса проникать в растение и распространяться в нем часто значительно уменьшается. Механизм ингибирования пролиферации вируса в присутствии генов белка оболочки точно не установлен, однако ясно, что противовирусное действие начинает проявляться на ранних стадиях рспликации вируса, так что вирусные частипы не образуются. Это снижает вероятность возникновения спонтанных вирусных мутантов, способных к рспликации в присутствии вирусного белка оболочки.
С помощью этого подхода были получены устойчивые к различным вирусам трансгенные растения множества различных зерновых культур (табл. 18.3). И хотя абсолютной устойчивости при этом достичь не удавалось, ее уровень был весьма высок. Более того, обнаружилось, что ген белка оболочки одного вируса иногда обеспечивает устойчивость к широкому кругу неродственных вирусов.
Ценность подхода повышается и благодаря тому, что трансгенныс растения развившотся одинаково как в полевых условиях, так и в лабораюрии. Молекула РНК, комплементарная транскрипту нормального гена (мр!!К), называется антисмысловой, а сама мРНК, участвулощая н трансдяции, - смысловой. Антисмысловая РНК образует дуплекс с мРНК, блокируя тем самым трансляцию, так что в ее присутствии синтез белкового продукта соответствующего гена уменьшается. Кроме того, дуплекс антисмьюловая РНК вЂ” мРНК быстро леградируст, что умсньшаег содсржшгие конкретной мРНК в клетке.
Учитывая все сказанное выше, можно ггонызаться предотвратить репликацию растительных вирусов и защи ппь от них растения, введя в них ген, обеспечивая>щий синтез антисмьшловых РНК, коллплсментарных мРНК вирусного белка оболочки. Таблица 78.Х Некоторые устойчивые к вирусам трансгенпьге растения, синтезирующие белки оболочки пнрусовп Внруеы — незочннкн генов ля«одопа Ьепгяопиогггс, М с!е«егапод 79. Ьегггьопглссгса, тыква М ьенгаот!оио, тыква Папойя, табак Вирус скрытой мозаики синан Каргофепь Вирус екручияанна листьев карзафепи Вирус У картофеля Вирус В картофеля Х картоФеля полосатости риса люзанкн резукн мозаики сон сраенроикн собака полосатости табака бронзоаом и гомата мозаики огоиерны мозаики огурст пм ремкппосгн табака табачгюй мозаики мозаики юматов П Ггсгааиныи работы Рсссбоо, Воаебз, Анси«.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
