Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 116
Текст из файла (страница 116)
18.1). Вектор содержал также: 1) ген устойчивости к спектиномицину (8рсг), позволяющий проводить отбор либо в Е. со/1, либо в А. !игле(ас!еал; 2) сайт инициации рснликации Е. со/!', 3) ген неомнцинфосфотрансфсразы пол контролем промотора и сайта тсрминации трапскрипциисгполиадснилирования гена нопалинсннтазы, цозволякнций проволить отбор трансформированных растительных клеток в присутствии канамицина. Кроме того, коицтегративный вектор содержал правую фланкирующую последовательность Т-ДНК нопалиновоп 'П-плазмиды и Гсн токсина В.с. Нравая фддпкирующая па«деда»»- тел»наст»ь рл>оз растительный сбдсктмпиыя маркерный гст [ген 14РТ) Е. сог>' «И Гомадогмчмая иасдсловптс>пность Таблица 18.2. Чувствительность трвнсгеинь>Х Растений тол!ага И растеНИй ДИКОГО тИПа к насекамыы-вредителям'> доля пппр«жд«нмых рис>«нвб мдм плодов, % Н»с«комп« Растения дикого типа транс»«нные рдст«иня б»д инсекта>юяпа б«з инс«ктнпядд с м>кектимидпм с мвсептмпмдом 47,5 20,1 99,7 3,75 Нс Опгсдсяястся 95,! Бражник Совка 1,25 6,4 94.2 0,(Ю Нс определяется 80.4 Высмчатакрыдая моль Рмс.
(3.1. Каинте>.ративиый к;к>лиру>ащий вектор, несущий ген ннсектицилнага токсина В. 11>иг(ля(елд(» (Вз.). Геи находится иад кагггралем сильного конститутивного 35$-ирс>мсиара (р355) вируса мозаики цветной капусты и сайта зерминацни транскрииции/иолиаденилираванмя гена иаиалинсинтазы (1(405). Вектор содержит также: сайт инициации реиликации Е. сод (ал) и >еи усгайчивасти к сиегтннамицину (Брет) „па абесиечивает его алщлмфикацию в Е.
сод и позволяет иравалмть отбор саатветству>ащмх клеток; правую фланкирующук> последовательность Т-ДНК; растительнъгй селективный маркерный ген; последовательность, гамалагичную иеанкагеинай Т(-илазмцде и абесиечивающук> интеграцию двух илж>ынл. Ген иеаыицинфасфатрансферазы (ХРТ) находится иад контролем элементов регуляции зранскрииции гена иаиалинси>пазы (р(чОВ и гр(ОБ) и используется лля а!бора канамицинустайчивых трансформированных растительных клеток.
сегмент октопиновой Тг-плазлсиды, обеспечивающий образование коинтсграта с «разоруженной» Тг-илазмилой с помощью гомологичной рекомбинации. Сконструированной плазмидой трансформировали Е со(1, а затем с помощью коньюгации перенесли сс в штамм А. гите1а- '> Поданным работы О«1»пп«у ст д!., вс«/>с«>и»ьху 7> 1265 — 1269, 1989. 1 синая инженерия растений: применение 39! ствлгь содержащий «разоруженную» Т>-плазмиду. После реколсбииацин в А.
гитеуас1ел.г укороченный ген иротоксина включался в хромосомную ДИК томата. И в оранжерее, и при полевых испытаниях трансгенныс растения томата, которые синтезировали укороченную форму цротоксина, проявляли некоторую защищегшость от таких насекомых, как бражник (Малс(иса хехса), совка, поврсждающая плоды томата (ТТе11011иг беа), выемчатокрылая моль (Ке(ггг)а 1усарет(се11а) (табл. 18.2).
Эффект был неодинаков для разных насекомых и не абсолютен: наиболее выражен он был в псрвыхдвух случаях. Иногда хороший результат давала обработка растений, синтсзируюших протоксин, химическим инссктицндом в низких дозах. Однако для того чтобы определить, как сщс больше уменьшить ущерб, причиняемый указаниыми выше и другими насекомыми-вредителями, необходимы дальнсйшие исследования. Для кардинального новь(щения уровня экспрессии использовались лва других подхода (табл. (8.!).
В первом случае методом сайт-специфического мутагенсза изменяли те участки выделенного гена токсина, которые могли бы быть ответственны за снижение эффективности транскриицин или трансляции в растенни-хозяине (в этих экспериментах использовали и табак, и томаты). При этом нуклеотидная последовательность измененного гена на 9б.5% совпадала с таковой у гена дикого типа. Трансгенныс растения, в которых экспрессировался такой «слабо» молифицированный гец, синтезировали в ! О раз больше токсина, чсм растения, трансформированные геном дикого типа. Во втором случае была разработана и синтсзирована химическими метолами «иолностью» 392 ГЛАВА 18 измененная форма гена токсина.
Такой ген содержал кодоны, чаще используемые растениями по сравнс1ггпо с теми, которые «прсдпочитаютл грамположитсльные бактерии. Выли внесены также изменения, нредотврагцающис образование вторичной структуры у мРНК или исключающие появление сайтов полиаденилирования, характерных для растений, что могло бы снизигг уровень экспрессии. СС-содержание чполностыо» измененного гена было равно 49% (для гена дикого типа эта величина составляла 37%), а нукпеотидная последовательность была только на 78,9% гомологична таковой гена дикого типа.
Трансгснныс растения, трансформированные сильно измененным геном протоксина. синтезировали в 100 раз больше токсина, чем растения, трансформированные геном дикого типа, цри этом наблюдалась прямая коррелянта с увеличением инсектицидной активности. Полученные данные позволякп надеяться, что аналогичным образом удастся повысить уровень экспрессии в рвете| ~иях л1ножесгвв других чужеролных генов. Количество синтсзирусмого в растениях протоксина попытались увеличить, осуществив экспрессию «полностью» измененного гена проток- сина под контролем иромотора гена малой субъединицы рибулозобисфосфат-карбоксилазьц помещенного после хлоропласгной сигнальной послеловатсльности этою фсрмента„таким образом, чтобы сверхпродуцирусл1ый протоксин был локализован в хлоропластах. Эта стратегия привела к радикальному повышению уровня экспрессии гспа протоксина, гак что на долю нротоксина стало приходиться до 1% всех белков листа.
В прутом эксперименте ген протоксина вводили непосредственно в хлоропластцую ДНК растения-хозяина. Это дает следующие преимущества. Во-первых, вводимый ген не нужно модифицировать, поскольку транскрипционный и трансля|1ионный аппараты хлоропластов относятся к прокариотичсскому типу. Во-вторых, на одну клетку приходится много хлоропластов„а на один хлороцласт — много копий хлоропластной ДНК, 1юэтому. ген проток- сина присутствует в большом числс копий. и эффективность сто экспрессии повышается. В- третьих, хлоропласты передаются только через яйцеклетку, а нс через пыльцу, так что растения наследуют хлоропластную ДН К по материнской линии и нет никакого риска нежелательного ~ ~срсноса гена протоксина с пыльцой на другие растения. Одна из форм гена протоксина уже введена и экспрессируется в таких растениях, как томаты, табак, картофель.
рис, кукуруза. яблоня, баклажан, канопа, люцерна, орех, тополь, слгь клюква и хлопок. Перспективы применения этого метола защиты растений кажутся весьма обнадсживающими. Так, в ~рансгенньгх растениях картофеля осуществлена эффективная экспрессия синтетического гена на основе гена инссктицилного токсина В. Яиппя(епзГх вар.
гепеЬпапй с кодовым словарем, используемым расзсниями. Полученные растения оказались высокоустойчивыми к колоралскому жуку, основному вредителю картофеля. Уже проведены успешные полевые испытания культуры в течение нескольких лет и получс но разрешение на ком мсрческос се использование в США. Следует помнить. однако, о необходимости постоянного контроля популяции насекомых-вредителей, с тем чтобы вовремя обнаружить устойчивые орюнизлця. Возможно, в будущем для защиты трансгенного картофеля придгпся использован более мощный протоксин В. гйиппягепзЬ или, что более всроятно, идентифицировать и кчонировать в растениях Лругие инссктицидныс гены в дополнение к генам протокспнов В.
17гиг1пягепзтх В настоящес время разрабатываются способы сниженияь сслсктивного давления со стороны трансгенных растений, экспрессирующих ген протоксина В. Йиппяяепегх, на устойчивых насекомых-вредителей. В одном случае экспрессию гена В. гйиппуепз(х в трансг вином растении ограничивали по времени. Для этого его помешали под контроль промотора гена табака РК-1а (от англ. рагйахепечз-ге!агег0, экспрессия которого предсшвляет собои шсть естественного механизма загциты табака от болезнетворных организмов.
Ге~~ РК-1а индуцируется любым патогенным организмом или химическим шснтом гила салициловой или полиакриловой кислоты. Обработав трансгенныс растения, несущие ген протоксина В. Йиг1пе)елях под контролем РК-! а-промотора, химическим индуктором, обнаружили, что они синтезируют инсектицид в Генная инженерия растений: применение 393 заметном количестве н течение! сут после обработки, и этого достаточно лля послсдугощсй загциты растений от насекомых-вредителей.
Таким образом, можно иидуцировать синтез протоксипа, обработан транс!силос растение недорогим и безопасным химическим вегпеством в определенный момент вегетационного г гсриода. Такая периодичность синтеза протоксина приводит к снижешпо селективного давления на устойчивых насекомых.
гхггалогичггьгс системы могут оказаться полсзнымн лля регуляции синтеза самых разных чужеродных белков в транс- генных растениях. Ни один из конкрегпгых типов протоксина 8. гггиггпхгецггу не может быть эффективным в отношении всех видов насекомых. В ходе энолкгции растения выработали общие механизмы защиты от насекомых, обсспсчивакгщие их выживание, однако степень этой зашиты нс всегда достаточна. Некоторыс растения синтезируют ингибиторы протеиназ, которые, попадая в кишечник насскомого, блокируют гидролгиз растительных белков. Разумгго было предположить, что сели выделить растительный ген ингибитора цротеиназ и снабдить сто сильным промотором, то можно будет создать трансг енпыс сельскохозяйственные культуры, способные синтезировать ипгибитор протсиназ н количестве, достаточном для защиты от насекомых-вредителей.
В одном из таких экспериментов с помощькз химически синтезированною ДНК-зонда из банка клонов комплемснтарной ДНК (кДНК) был выделен клон, кодиругощий ингибитор трипсина вигны китайской. (При синтезе ДНК-зогьта руковолствовашись амипокислопюй последовательностью этого белка.) Полноразмерную кДНК субкчонировали в бинарном векторе на основе Тг-плазмиды (рис. ! 8.2) и ввели в штамм А.
гатеХасгеьй содсржагпий нсонкогснную Тг-плазмиду с активными ггг-геналги. После, инфицирования листоных дискон табака А. Гите~асгегм этим вектором клетки, содержащие комплсментьрную ДНК, отбирали по способности к росту в присутствии канамицина и регснерировали из них трансгснцые растения. Ущерб, наносимый личинками Неггаггггу гггеггепг (совки) трансгенным растениям, синтезирующим более 2 мкг ингибитора трипсина на ! мг растительного белка, был значительно меньше, чем н случае обычных растений. Г ея вгггибихорв трвпсвна вигны китайской Ген Яэ»1' Рис. (8.2. Бинарный юлоггирующггй вектор, иссушив ген ингибятора трипсина вигньг китайской.
Вектор солержит сайг инициации репликвггии ДНК лля широкого круга хозяев (агг) и геп устойчивости к канамицииу (Кап'), который фуггкцвоггируег как в Е согг', так и в А. гааге)ггсгепж Между правой (П) и левой (Л) фланкирующими посггедовательностями Т-ДНК находятся: !) геи неомицинфосфгпрансфервзы (МРТ) под контролем элементов регуляции транскрипции гена иопвлиисигпазы (РЫ)8 и Г(ЧОВ), что позволяет проводить отбор канамицинустойчивых зрансформированцых растительных клеток; 2) ген иигибиторатрипсипа ватны китайской, находящийся пол контролем 358-ггромсаорв (Р358) вируса мозаики цветной кмгусгы и сигнала герминации траггскрипции/ггоггигьлеиилироваггия гена иопалннсиитазы (ГХОВ).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
