Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 119
Текст из файла (страница 119)
Например, в клеточной стенке фитолакки американской (Рйуго!асса атепсала) присутствуют три разных противовирусных бслкгс РЛР, синтезируемый в листьях весной, РЛРП, обнаруживаемый в листьях летом, и РЛР-5, содержащийся в семенах. Эти белки легко вылелить из водных экстрактов измельченных тканей растения.
Если небольшое количество РАР нанести на лисгья лругих растений, то послслние также окажутся устойчивыми к нескольким вирусам. Гакам образом, ген белка РАР вполне можно использовать лля получения трансгснных растений, усчойчивых к широкому спектру вирусов растений. Выделенную кДНК РЛР вводили в геном табака и картофеля с помощью бинарных векторов на основе Т1-плазмид. Трансформанты, синтезирующие РАР в большом количестве (>10 нг на ! мг суммарного белка), были чахлыми, пятнистыми и бесплодными. растения же с более низким содержанием РАР (! — 5 нг на 1 мг белка) имели нормальный внешний вид и были фсртильны.
Эти данные говорят о том, что если концентрация РЛР превышает некоторый пороговый уровень, то нормальное функционирование клетки нарушается. Противовирусный эффект белка РЛР в трансгенных растениях проявляется в основном в уменыпении числа повреждений; однако, если уж повреждение возникало, то растение систематически инфицировалось. Отсюла следует, что РЛР подавляет вирусную инфекцию на ранней стадии.
Тем не менее, когда трансгснные растения табака и картофеля, зкспрсссируюп!ие РЛР в нсболыиих количествах, инфицировали вирусами картофеля Х или 1', на листьях обнаруживалось значительно меныпе повреждений, чем в случае не- трансформированных контрольных растений. Поскольку противовирусное действие РЛР проявляется при относительно небольших его концентрациях, можно попытаться создать трансгснные растения, синтезирующие этот белок в малом количестве, и параллельно использовать другие способы защиты растений от вирусов. Растения, устойчивые к герба!(идам Несмотря на то что на производство более 100 различных химических гербицидов во всем мире ежегодно расходуется !О млрл. лолларов, при- мерно 10% урожая теряется из-за большого количества сорняков.
Кроме того, многие гербициды оказывают одинаковое действие на сорняки и сельскохозяйственные культуры; нередко обработку полей необходимо проводить еше до появления сорняков, а некоторыс гербициды накапливаются в окружакицей среде. Чтобы решить хотя бы нскоторыс из этих задач, можно попытаться создать сельскохозяйственные культуры„устойчивые к гербипидам.
Для этого можно ° уменьшить поглощение гербипида растением ° обеспечить синтез белка, чувствительного к гербициду, в таком количестве, чтобы его хватало на выполнение присущих ему Функций в присутствии гербицида уменьшить способность белка, чувствительного к гербипиду, к связыванию с ним ° обеспечить инактивацию гербицила в растении в ходе метаболизма. Из этих подходов были реализованы три последних. Выведенные с их помощью гербицидустойчивые трансгснные растения перечислены в табл.
18.4. Были получены растения, устойчивые к глифосфату — гсрбицилу, быстро разлагающемуся в почве на нетоксичные составляющие и потому безопасному для окружающей среды. Глифосфат является ингибитором 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (ЕРБРБ) — фермента, играющего важную роль в синтезе ароматических аминокислот и у бактерий, и у растений. Из глифосфагустойчивого штамма Е. сои был выделен ген, кодирующий Е РВА, помещен под контроль растительного промотора и сигналов терминации транскрипции/палиаленилирования и введен в растительные клетки.
Трансгенныс растения табака, петуньи, томата, картофеля и хлопка, синтезировавшие ЕРБРБ в количестве, достаточном для замены ингибированного гербицилом растительного фермента, были устойчивы к глифосфату и при обработке, в отличие от сорняков, не погибали.
Другой способ приобретения устойчивости— с помощью инактивации гербицида — был реализован для бромоксинила (3,5-дибром-4-гид- Габлссла 1с(ч'. Некоторые примеры генетически обусловленной устойчивости к гсрбнцндам Способ яриебретеиия уетайчююсти Гербицид Изменение гена рзЬА. колируюшего юсорзпяас псый белок О-!, на который атас сербицид дейссаует Ваелепие а расопельиый генам генов, кодирусосцих )стойчнаые формы ацезолактаз синэ етгаы (с сны ааодилнсь а растения тополя, каишсьс, льна и риса) Осбар а культуре хлеюк линий.
синтезируюшнх устоичиаые бюрмы ацетояактатсннте саэы еэги гегбицисгы ингнбируют ацетил. СоА — карбоксилазу. Осбор проаоаился а культуре тканей. Угяойчзспзсть обеспе шаалась либо изменением фермента, так по ои становился нечуасташ ельным к гербициду, либо разрушением гербимюа Устоичиаош ь обеспечнаается саерхпродукцией фермента ЕР8Р5, на кагоры й аейстаует шоз гсрбицид. Устайчиаасз ь приобретассся трансформацией саи тес юм ЕР8Р52 устойчиаой к гдифосфюу, и шбака геном глифосфагаксидоредуюазы, которая разрушает слифосс)мс Усзойчнаасть к этому нипсбитору фотасистемы П обеспечиаается срансформассзсей табака иаи хлопка бактериааьным геном низ рсшаэы, кадируюшим фермент, разрушаюсссссй гербицил Уссойчиаые растения сабака и хлопка быяи созданы зрансфармацией геном рс(А нэ А(савхеаез.
кодируя>псин аиаксисеназу. которая разрушает гербнпиа Более 20 различных растений быяи зрансформирозины либо геном Ьаг из Лсгерсамусаз ьукгсасар(сиз, лигю гессссм рас из х з(гссгаеьсэмахезсез. Фасфинотрицинацетиатрансфераза, кадируемая этзсми сенами, обеспечивала детокснкацию Усгойчиаые растения табака получали ари введении гена с шанамидгидратазы из гриба Ь(ус оевееечм гег«аеас(а. Фермент, колируемый этим сеном, катализируез преарашение цианамида а мсясеаину Расмния табака трансфюрмироааэи геном депюагепаэы Рзеадеаюпаз риг(аа, которая Яеюпечиааза лшоксикшшю Триазины Сульфонияуреазы Нмилазсаиноны Арнлоксифеноксипропионагы.
опклоге ксапаиш сы ( я ифосфат Броиоксинил Фенаксикарбоксилышсе кислоты (например. 2.4-О и 2,4.5-Т! Писк)юзинас (фосфинотрицин) цнанамид Дадапои СООН Нзстрзсзсаэа В В Вг Вг ОН бромоксинил ОН 3,5-аибрам- -4-гилроксибенэойная кислота 25 — 5 с 55 рокснбснзоннтрнла) — гсрбнцнда, который ингнбнруст фотосинтез. Устойчивые растения создавалн путем введения в нх гоном бактсриального гена, коднрующсго ннтрнлвзу, которая ннактивнруст бромокснпнл сщс до того„как он начинает действовать (рнс. 18.!0). Из почвенной бактерии К1есзз(еНа агаепае был выдслсн ген ннтрилазы, помсшсн под контроль светочувствительного промоторв гена малой субъсднницы Рис. 18.10.
Инактивацгш гсрбнцнла бромокснннла при помощи низрьшазы К. агаеиае. Генная инженерия растений': применение 40! ргибулозобнсфосфвт-карбоксилазы н встроен в геном табака. Трансгснные растения су(птсзиро- вали активную нитрнлазу н были устойчивы к бромокснннлу. Растения, уеглойчиаые к грибам и бактериям Фнтопатогснныс грибы наносят весьма ощутимый вред сельскохозяйственным культурам. По оценкам, убытки, которые терпят фермеры КЭго-Восточнойт Азии, Японии н Филиппин в результате поражения грибом, вызывающим пирикулярпоз, одного нз основных зерновых этого региона, ряса„исчисляются примерно 5 млрд. долл.
в год. Сейчас основной способ борьбы с фнтопатогсннымн грибами состоит в обработке растений химическими всществамн, которые нвквплнввются в окружающей срслс н представляют опасность для животных, в том чнслс и лля человека. 1! оэтому очснь важно выработать лругне, простые, недорогие, эффсктнвныо н безопасныс для окружающсй среды нсхнмнчсскне методы защиты ссльскохозяйствснных культур от грибов. 402 ГЛАВА 18 Ряс. !8.П. Плазмвдный вектор, содержащий кластер генов хпгиназы риса я кластер гегюв устойчивости к гигромипину, использовавшийся для трансформации протопластов риса, Трансформацию осуществляли обработкой протопластов пелиэзиленгликолсм в присутствии плазмидпого вектора. Затем атбирази клетки, устойчивые к гягромицину, и проводили тестирование клеток ыа наличие генов хиз иназы с помощью гибридизации по Саузерну в на наличие самой хитвназы методом Вестерн-блоттинга.
Далее из клеток регенерировали целыс растения. Часто в ответ на проникновение патогснов растения начинают синтезировать группу специфических РК-белков (от англ. ра(йойепеейге!а!ег! ргогешз). В эту группу входят !3-1,3-глюканаза, хитииаза, тауматннподобные белки (таумпгин — небольшой, очень сладкий белок) и ингибиторы иротеиназ; все они так нли иначе воздействуют на патогены.
Имея это в виду, учение попытались вывести растения, устойчивые к болсзнстворным грибам, способные консгитутивно зкспрсссировать гены олного или нескольких РК-белков. Так, были получены трансгенныс растения, синтезирующие в большом количестве хитиназу, фермент, гидролизующий !3-1,4-связи в молекуле !Ч-ацетил-О-глюкозамина, основного компонента клеточной стенки грибов (рис.
! 8.! 1). Срели таких растений были рис, табак и канопа. Соответствующие гены, введенные в растительный геном, были поставлены под контроль 355-промотора вируса мозаики цветной капусгы. Кроме того, были созданы трансгснныс растения табака, которые конститутивно синтезировали нс только хитиназу, но и !3-глюканазу. Такис растения были получены скрещиванием одного трансгснного растения, экспрессирующсго ген хитиназы, с другим, экспрессируюшим ген р-глюканазьь Трансгенные растения, синтезируя>щис хитиназу, были более устойчивы к болезнетворным грибам, чем контрольные, даже при том, что последние синтезировали собствсиныс РК-белки в ответ на инфицирование грибами.
Кроме того, при этом способность полезного гриба 6!агиих июхгеае закрепляться на корнях растений никак нс нарушалась. Возможгю, это связано с различиями в составе клеточных стенок данных грибов. Существенно, что трансгсн- ные растения, конститутивно синтезирующие хитиназу, не были подвержены грибковым заболеваниям в полевых условиях. По-видимому, описанный подход окажется весьма эффективным способом защиты растений от патогенных грибов. По оценкам, ущерб, наносимый урожаю картофеля в результате поражения этой культуры патогенной почвенной бактерией Егя'ппа сага!о»ага, составляет примерно !ОО млн.
долл. в год. Положение усугубляется тем, что у растений нс выявлено никаких способов защиты от данной инфекции, которые можно было бы использовась для выведения устойчивых коммерческих сортов. Чтобы решить эту проблему, группа исследователей вывела трансгенные растения картофеля, активно экспрсссирующие ген лизоцима бактериофага Т4. При этом лизоцим секрсгировался в апопласг (мсжклеточное пространство), компартмент, в который проникает и где распространяется Е. сага!а»ага.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
