Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 114
Текст из файла (страница 114)
Врс' — ген устойчивости к спсктинамнцину. Вначале чужеродные гены вводили в ДНК хлороиластов в составе илазмидного вектора, несущего неселектнвную чужеродную ДНК и селективный маркер, например ген устойчивости к антибиотику, флаикнрованные специфическими последовательностями хлороиластной ДНК (рис. 17.7). Такая стратегия была весьма эффективной, однако нередко селективный маркер мешал экспрессии фланкнруюшнх хлоропластных генов. Чтобы решить эту проблему, разработали стратегию„в которой селективный маркер и чужеродный ген не были физически связаны друг с другом.
Для этого растения табака трансформировали смесью одинаковых количеств двух разных плазмид: одна содержала селективный маркер (ген устойчивости к спектнномнцину), фланкированный ДНК нз одного участка хлороиластной ДНК, а вторая — чужеролный ген (ген устойчивости к канамнцину), фланкнрованный последовательностями из Лругого участка Рис. 17.8. Плазмнлные векторы, используе- мые лля встраивания в хларапластную Л11К двух генов — селективнага и неселекгивяага. йрс" — ген устойчивости к спектинамииину. Генная инженерия расгений: мезалалагия 385 Сепгенты хзарапяаетная ДИК хлоропластной ДНК (рис. 17.8).
Оба гена имели ирокарнотические сигналы транскрипции, что обеспечивало их транскрипцию в хлоропластах, но не в ядре. Последовательности хлоронластной ДНК в плазмиде были организованы таким образом, что рекомбииаиия или встраивание в геном хлоропластов не приводила к нарушению работы какого-либо хлоронластного гена. Плазмилы ввалили метолом бомбардировки микрочастицами, а затем отбирали трансформированные растения табака на среде со спсктиномицнном. Хлоропласты из отобранных трансформантов проверяли на наличие пролукта, дстерминнруемого геном устойчивости к канамицнну (нсселективным чужеролным геном).
Удивительно, что примерно 30% спектиномнцинустойчивых трансформантов эксиресснровали также ген устойчивости к канамнцину. что указывает на применимость котрансформацин для введения чужеродных генов в хлоропластную ДНК. 386 Г5!АВА !7 Селективный Гап, Л Гзз изйю~ Оз т!кзиепазязя Рис. 17.9. Схематическое представление '1'-ДНК, входящей в сасшв вехтара. После интеграции Т-ДНК в хра- масамную ДН К растения траиспазаза может вырезать селективный маркерный ген и встроить сга в другая храмасамный саит. Обозначению Л и П вЂ” левая и правая фланкирующие последовательности, Оз — мобильный элемент.
Праматары и сигнал»я термииации транскрипции гена траисиазазы, гена, интересующего исследователя, и селективиа! а мархернага гена ие показаны. Получение трансгенных растений, не содержащих маркериых генов ДНК между Оз-элементами и перемещает его в другой хромосомный сайт (рис. 17.9). В процессе встраивания Т-ДН К в ДНК растения-хозяина в 90% случаев селективный маркер„нахолящийся между двумя Оа-элементами, оказывается в друюм сайте хромосомной ДНК, при этом с вероятностью 50% этот сайт находится далеко от исходною. Таким образом, селективный маркерный ген может использоваться для идентификации трансформированных растений, а затем улаляться при скрещивании. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Обычно при введении чужеродного гена в растение одновременно вводится и селективный маркерный геи.
Хотя до сих пор не было никаких указаний на то, гго ка«ой-либо из этих генов оказывает неблагоприятное воздействие на человека, животных или окружающую среду, последствия, к которым в принципе может привести включение в растения селективных маркерных генов, вызвали беспокойство общественности. Например, продукты некоторых маркерных генов могут оказаться аллергеиами или такси !ными веществами, а гены устойчивости к антибиотикам могут попасть в з!атогенньзе почвенные микроорганизмы. Кроме того„присутствие селективных маркеров технически затр)чзняет трансформацию трансгсниых растений дополнительными генами„поскольку один селективный маркер не может использоваться дважды.
Чтобы успокоип* обшественносттч были разработаны метолы получения трансгтяшых растений без каких-либо маркерных генов. Один из экспериментальных подхолов к получению безмаркерных трансгенных растений включает котрансформацию растений двумя разными ДНК, одна из которых несет маркерный ген, а другая — интересую!ций исследователя чужерошгый ген. В этом случае от 30 до 80% растений содержат оба гена, которые, однако, ии)егрированы в разные сайты хромосомной ДНК. После отбора трансформантов маркерный геи можно удалить из траисгениого растения с помощью обычного скрещивания.
В рамках другого подхода селективный маркерный ген встраивают между растительными мобильными элеме!!тами (Оа-элементами) и таку!о конструкцию вводят в Т-ДНК вместе с геном траиспозазы, которая вырезает участок С ! юмошью генной инженерии можно вводить чужеродные гены в растительные клетки в культуре с последующей регенерацией целых фертилы!ых растений из отобранных трансформированных клеток.
Естественным путем трансформация растений осуществляется с помощью почвенных бактерий Аробасгег!ил~ Гилзстас!елз. При поражении растения в нем начинает синтезировагься специфическое вещеспю. В ответ иа этот химический сигнал А. гизлеГас!елх прикрепляется к мембране растительной клетки, после чего происходит !!еренос части (Т-ДНК) бактериальной шчазмиды (Т)- плазмиды) в ядро растительной клетки. Т-ДНК встраивается в растительный геном и эксирессируется.
Т-ДНК содержит гены, кодирующие ферменты синтеза фитогормоиов, которые вызывают увеличение размеров растительных клеток и их пролиферацию. Кроме того, растителы!ые клетки начинают синтезировать опии, кодируемый ТДНК, который может использоваться только А. !игле(ас!елх Таким образом, в процессе эволюции сформировался механизм превращения растительной клетки в «фабрику» ио производству вещества — источника углерода и азота (оиииа) исключительно для нужд А.
гилзе7ас!елз. Генная инженерия растений: методология 387 Чтобы использовать природную способность Л. »и»пе(ас»епк проникать в растительные клетки лля доставки в них кло»ированных генов, были созланы модифицированные Т>-плазмиды. Из Т-ДНК удаляли гены фитогормонов и гены метаболизма олина и встраивали такую измененную Т-ДНК в плазмиду, способную стабильно существовать в Е.
сод. Встроенный в Т-ДНК ген-мишень попадю> вместе с ней в ячро растительной клетки-реципиента. В случае бинарной системы челно*>ный вектор с клоннроваиным в Т-ДНК геном вводят в штамм Л. »ип»еГас»ег>к, несущий модифицированную плазмиду с генами, необходимыми лля переноса Т-ДНК в клетку растения (ч»г-генами).
Кроме того, разработана коигпегративпая система, которая предполагает введение челночного вектора в Л. 1итеГасрепгл где он рекомбинирует с неонкогещюй Т>-плазмидой, несущей ч»г-гень>, с образованием одной плазмилы, в которой сеть и функционирук>щие иг-гены, и Т-ДН К с клопированным геном. Участок Т-ДНК Л. »итеГас»епк использовали лля введения генов в различные растения. К сожалепик>, эта система применима не для всех видов растений. Эффективным методом доставки ДНК в различимо растительные клетки являетя также бомбардировка микрочастицами (биолисгика).
Для обеспечения экспрессии чужеродных генов, введенных в растительные клетки, использовали растительные промоторы. Различные промо»оры, функционирун>щие только в определенных растителыпях тканях или на определенной стадии развития растения, идентифицировали по экспрессии репортерного гена без промотора после его интеграции в хромосомную ДНК растения.
Были разработаны мет>здь> встраивания чужеролных генов непосредственно в хлоропласгную или митохондриальную ДНК так, чтобы колируемый белок спнтезировался прямо в этих органеллах. И наконец„для того чтобы успокоить общественность, были разработаны методы удаления маркерных генов из трансгенных растений. ЛИТЕРАТУРА Аи С., Ъ'. Кип. 1993. Тесйп)г)пек Ги (во1аг)пд ап») сйагасгеп>йпд р!ап( !гапвспрйоп ргопю1егк, епЬапсегк, апг(гегшшаюгк, р. 155 — 166.
Гп В. К. Ойсд, Л. Е. Пю>иркол (ед.), Ме»»>аФ т Р»ап» Ма»еса1аг В»о!оду ап»» В»о»ес»пн>!оду. СКС Ргекв, Васа Ка1оп, Е1а. Саггег Н., Р. Майда. 1995. Та»де!ад >пкеиюп оГ Гоге>дп денек пдо Гйе гоЬассо р!ак(Ы депоп>е >ч)!йонг рйугдса! 1шйаде 1о Гйе ке1есгаЫе п>аФег депе. В»а/»ес»»па1аду 13» 791 — 794, СЬг(в(ои Р. 1992. Сепейс ггапк1оггпагюп оГ стор р!»>пгк пкй>д гп>сгорго)есрйе ЬогпЬап1п>еп!. Р1ап» Х. 2: 275-28!. )3а)е Е. С., В. Ои. 1991.
Оепе ггапйег чч>ГЬ кпЬвег)т>еп( гсшоча! о( гйе ке(есйоп депе Ггош Гйе Ьом депо>пе. Рп>с. А>аВ. Лса»1. 5с». ()оа 88: 10558-10562. Оо(»)вйгоидй А. Р., С. Х. 1 ак1гейа, Л. 1. Ъодег. 1993. Тгапкрояйоп шег))агег) ге-ров)1)о»>Ь>д апд впбве- 9>>оп( е1 шипа(юп оГ гпаг)гег денек Ггош 1гапкдеп(с (оп>аю. В»о/Тес»>па»ад> 11: 1286 — 1292. ОгоЬег М.
Ч., %. Е. СгокЬу. ! 993. Чес1огк Гог р(ап1 ггапвГоппагюп, р. 89 — 119, Гп В. К. О>1(с)г, !. Е. ТЬошрвоп (е»1.)„Ме»»»о»»к »п Р»ап» Мо!еси»аг В»о1аду ап»1 В!а»егйпа»аду. СКС Ргекк, Воса Ка1оп, Е(а. На1йег ()., Р. С. Могг!в, 1. %Шш((хег. 1992. С>епе гагдейпд >п Лга»>Ыарк(к»»>а»»апа. Ма».
Сеп. 6епе». 231: 186-193. 1вЬ(да Ч., Н. Вайо, Я. ОЬ(а, Ъ'. !Вей Т. Кнпап, Т. Кишавй)го. 1996. Н!дЬ ерйс>енсу ггапкГоппайоп оГ шаьзе (7еа тау> 1.) шсгйа»ес! Ьу Лдгайас»гпигп»и»пе(ас»еп»ь !>а», В»а»ес»»по». 14: 745-750. Ле(Гегвоп К. А., Т. А. КачападЬ, М.%. Вечап. 1987. О()8 Гг>в(опв: р-д!г>сь>гопЫаве ак а кепвйпе апг) чегкагйе депе Гцкюп >наг(гег >и Ь)дйег р(апгк. ЕМВО Х 6: 3901 — 3907. К1еш Т.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
