Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 111
Текст из файла (страница 111)
Переход Т-ДНК в одноцепочечную форму начинаетсн с внесения в нее разрывов по обеим фланкирующим ее последовательностям. При этом правая фланкирующая последовательность оказывается ьи 5 -конце одпоцепочечнои ТДНК, а левая — на 3'-конце. Предполагается, что интеграция Т-ДНК в геном растения зависит от специфических последовательностей, локализоваьшых в правой фланкирующей последовательности, которая содержит повтор длиной 25 и.
и. Аналогичный повтор присутствует и в левой последовательности, однако, как показывает делеционный мугагенез, она не принимает участия в интеграции. Большинство юнов Т-ДНК активируются только после ее встраивания в геном растения. Их продукты и вызывают образование корончатого галла. Гены (ааМ и (ааН, известные также как Гьнз) и йа32 соответственно, кодируют ферменты, принимающие участие в синтезе растительного гормона ауксина (индолилуксусной кислоты).
Геп ьааМ кодирует фермент триптофан-2-монооксигеназу, которая катализирует превращение триптофана в индолил-З-ацетамид, а ген (ааН вЂ” фермсьп индолил-З-ацетамилгидролап, катвизируюизую образование индолилуксусной кислоты из индолил- 3-ацетамида (рис. 17.4, А). Кроме того, Т-ДНК несет ген Гтг(известнььй также как ген йз), кодирующий изопеьпилтрансферазу — фермент, который катализирует присоединение к 5'-АМР изопреноидной боковой цепи с образованием цитокининов изопентениладенина н изопентениладенозинмонофосфата (рис.
17.4, Б). При гидроксилировании этих соединений растительными ферментами образуьотся питокинины трансзеатин и трансрибозилзеатин соответственно. И ауксин, и цитокинины регулируьот рост и развитие растительной клетки, но, присуьствуя в избытке, могут вызывать у растений образование опухолей, таких как корончатый галл. Кроме генов ауксина и питокинина„Т-ДНК каждой специфической Т(-плазльиды солержит ген, детерминирующий синтез соединения из класса опинов. Олины — это уникальные продукты конденсации амино- и кетокислот или аминокислот и сахаров. Наприльер, при конденсации аргинипа и пировиногралной кислоты образуется октопин, арпшнна и ьх-кетоглутаральдегида — нопалин, а бициклического производного глутаминовой кислоты и сахара — агропин (рис.
17.5). Опины синтезируются в корончатом галле, а затем секретируются. Они могут использоваться как источник углерола (а иногда н как источник азота) любой А. (иьлеГасьеаз, которая несеь в Ть-илазмиде ген(ы) катаболизма соответствующего олина (рис. !7.3), локализованные вне Т-ДНК. Большинство лругих исследованных почвенных микроорганиз- НН2 Ны= С НН вЂ” (СН ) — СН вЂ” СООН 23 ын СН3 СН СООН Октапнн ын НЫ=С НН вЂ” (СН ) — СН вЂ” СООН 23 ын 1 НООС вЂ” (СН,), — СН вЂ” СООН Нонвлнн О ОН ОН ОН А~Рован Рнс.
17.5. Структурные формулы трех опннов: октопина, нопалнна н агропнна. мов не способны использовать опины как источник углерода. Таким образом, в процессе эволюции выработался уникальный набор механизмов, посредством которых каждый илами А. йнле)астелх генетически трансформирует раститсльные клетки в биологические фабрикиь по производству соединений углерода, использовать которые могут только сами эти бактерии. Векторные системы на основе Т!-нлазмнд Самый простой способ использования природной способности Т1-плазмид к генетической трансформации растений предполагает встраивание интересующей исследователя цуклеотидной последовательности в Т-ДНК, а затем использование Т(-плазмид и А.
тигле(поела для доставки и встраивания клонированного 1ена (генов) в геном компетентной растительной клетки. Однако, несмотря на то что Т(-плазмиды являются эффективными природными векторами, имеется ряд серьезных ограничений на их использование в качестве векторов для клонирования. ° Фитогормоны, синтезируемые трансформ ированцыми клетками в культуре, подавляют регенерацию из этих клеток зрелого растения, поэтому при конструировании векторов на основе Т(-плазмиды гены ауксина и цитокини на должны быть удалены. ° Ген опина несуществен для транс~ енных растений, но при его наличии можст снижаться конечный выход биомассы, поскольку часть ресурсов расходуется на синтез опица.
Следовательно, при создании векторов ген оцина также должен быть удален. Т)-плазмиды имеют очень большой размер (от 200 до 800 т. п. н.), а для экспериментов с рекомбинантцыми ДНК нужны векторы меньшего размера, поэтому участки ДНК, несущественные для клонируюшего вектора, должны быть удалены. ° Т(-плазмиды не реплицируются в ЕхсйенсЫа со)(, что исключает работу с рекомбинантными 'П-плазмидами в этих бактериях.
Следовательно, при конструировании векторов на Генная инженерия расгений: мешдология 377 основе Т)-влазмид необходимо ввести в них сайт инициации рспликации, обеспечивак>- щий их поддержание в Е со)Е Несмотря на все эти сложности было сконструировано несколько векторов для растительных клеток. Все векторы на основе Т1-плазмид ор1 анизованы сходным образом и имеют следующие элементы. ° Селективный маркерный ген, например геп неомигшпфосфотрансферазы, который обеспечивает устойчивость трансформированных растительных клеток к капамицину.
Поскольку этот ген (как и многие другие маркерные гены, используемые црн трансформации растений) по своей природе прокариотический, необходимо поставить его под контроль растительных (эукариотнческих) сигналов регуляции транскрипции, в том числе промотора и сигнала тсрминации-полиаденнлирования. Зто обсспечит эффективную экспрессию гена в трансформированных растительных клетках.
° Сайт инициации репликапии, который позволяет плазмиле реплицироваться в Е. со(Е Некоторые векторы содержат также и сайт инициации репликации А. мгле/агтвлх. е Правая фланкирующая последовательность Т-ДНК. Зтот элемент абсолютно необходим лля интеграции Т-ДНК в клеточную ДНК растений.
Большинство же векторов содержат как правую, так и левую фланкирующие последовательности. Полилицкер (множественный сайт клонирования) для встраивания гсца в участок между границами Т-ДН К. Поскольку клонируюьдис векторы нс содержат ~снов г1б они сами пе способны обеспечивать транспорт и инте~рация~ Т-ДНК в клетки растения-хозяина. Чтобы решить эту проблему, было разработано два подхода. В первом случае используют бинарную векторную систему (рис.
!7.6, Л). Бинарный клонирующий вектор содержит сайты инициации рспликацин и для Е. соя', и для А. ште/ас(елх, по не несег генов ю; т. е. зто практически челночный вектор Е. со()в А. Ште~аг(с~и. Все стадии клонирования прово- Генная инженерия растении: левгадался ня 3?9 Физические методы переноса генов в рйстительные клетки Рне. 17.6. Две нектарные системы на основе Т(-1твазмшь А. Бинарный кланнрующий вектор содержит сайты инициации реплнкаинн (оп) н для Е са>с н для А. гасив>ае>впв (лнба сайт нннцнапнн реплнкапнн для широкого круга хозяев), селективный маркерный ген, который мажет быть использован либо в Е.
са1й лнба в А. сите/асмш, а также интересующий исследователя ген и растительный селективный маркернын ген, встроенные в ТДНК. Б. Каннтегратнвный кланнрующнй нектар (ввврх>) содержит санг нннпнацян реплнкацнн талька для Е. сад н не может автономно существовать в А. сите?ас!впж Оп также несет селективный лсарксрный ген, казарын нс сии ьзуется либо в г", со(1, либо в А. сите!ае(епж правую фланкирующую паслелавател ьнасть Т-ДН К (П). растительный селективный маркерный ген, ген, который' нужна ввести в геном, н фрагмент'П-плазлснлы, гамалагнчный участку ДНК пеанкагеннай («разаруженнай») Т1-плазмнды. Неапкагенпая Т(-плазм>!да (в середивв) салерхснт левую фланкнру~аасую последовательность Т-ДНК (Л), кластер Иг-генав н сайт нннцнацнн реплнкацнн А.
гитерас(епв (ап). Гамалагнчная рекамбннацня каннтегратнвнсяа кланнрующега вектора с неанкагеннай Т! -плазмндай ласт рскамбннантную плазмнду (вниз>), которая несет кланнраванный ген и расснтельный репартерный ген, флацкнраванные правой н левай канцевымн последовательностями Т-ДНК. лят в Е. са1с, а затем вектор вводят в А. сипеГасГепя Штамм-реципиент А. гитис?атеты несет молифицированную неонкогеннук> («разоруженнуюл) Т1-плазмиду; она содержит полный набор л(г-генов, по из нее удалена часть (или вся) Т-ДНК (так по Т-ДНК не может быть транспортировапа).
В этой системе на псопкогенной Т)-плазмиде синтезируются пролукты г(г-генов, которые мобилизуют участок Т-ДНК бинарного клонирулощего вектора. Пролуцируя белки, копируемые т(г-генами, неонкогепная Тйплазмида выступает в роли помощника, способствуя встраиванию Т-ДНК из бинарного клонируюгцего вектора в хромосомную ДНК растения. Во шаром случае используют кои~ ~тегративную векторную систему.
Векторная ДНК рекомбинирует в А. (итера(ет с «разоруженной» Тйплазмндой, Т-ДНК которой не несет опухолеродных генов, ~аким образом, что весь клопирующнй вектор встраивается в неонкогеннук> Т1-плазмиду (рис. !7.6, Б). Коинтегративный вектор и пеонкогенпая Т)-плазмида-помощник содержат гомологичные последовательности, которые образуют сайт лля гамологичной рекомбинации ш т(то. Обы шо эти послеловательности расположены в Т-ДНК. После рекомбинации клонируюший вектор становится частью неопкогенной Т1-плазмиды, которая содержит г(«-гены, необходимые для переноса Т-ДНК в растительную хозяйскук> клетку. Елипственный способ поддержания клопирующего вектора в А.
гите/ис(епв — это использование такой коиптегративной структуры. В данной конфигурации генетически сконструированный участок Т-ДНК может быть перенесен в растительные клетки. Системы переноса генов с помощью А, гите?асгепв эффективно работают только в случае некоторых видов растений. В частности, одподольные растения, включая основные зерновые культуры (рис, пшеницу и кукурузу), практически не трансформирулатся А.
Гиллера(епв. Тем не менее, модифицирован метолики и тщательно контролируя условия, удалось трансформировать кукурузу и рис агробактериями А. (итеуас(епв, несущими векторы — производные ТН плазмид. Так, например, незрелые заролыши кукурузы помещали на несколько минут в суспензию клеток А. гитеуас?епгь а затем инкубировали несколько дней в отсутствие селективного давления. После этого зародыши переноснлн в среду с антибиотиками, в которой могли расти только трансформированные растительные клетки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
