Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 107
Текст из файла (страница 107)
Дврхсн)уненчггтая ферлгентаиил в одном реакторе с механическил~ неремегииванием Трсхкомпонснтный рекомбинантный белок АСфйа1, использующийся при проведении иммунологических тестов, синтезировали в промьппленных масштабах в одном биорсакторс с механическим псремешиванием. Ген этого белка бьш сконструирован методами генной инженерии и содержал сегменты, копирующие пять сайтов связывания иммуноглобулина С (!яС1) А- белка Егарй) 1ососсш аигеиз, лва санта связывания !яС С-белка штамма Ь!48 Ягергососсиз и !)-пиактозилазу Е. сон. Он нахолился пол контролем промотора ра бактсриофага )., регуляция которого осуществляется так жс, как регуляция рьпромотора, и был встроен в плазмилу, несущую ген устойчивости к ампицнллину; этой конструкцией трансформировали клетки Е.
со(1. !Птамм с плазмилой, несущей ДНК АС)!)ка), содержал вторую плазмилу. ~~есушую ген тсмпсратурочувствительного белка-репрсссора с! и ген устойчивости к канамицину. Культуру в объеме 5 л выра1цивали при 30 'С в присутствии ампициллица и канамицина, с тем ~тобы обеспечить условия для сохрагвшия обеих плазмил, а затем использовали в качестве посевного материала для инициации роста культуры без акгибиотиков при 30 'С в реакторе с рабочим обьемом 45л. Суспензия клеток из 45-литрового фсрмснтера в свою очередь служила посевным материалом для культивирования в биореакторс на 600 л, в котором клетки продолжали выращивать при 30 'С без антибиотиков (рис.
!6.6). (Вообшс гово!)я, для уме„ьи!Сник стоимости процесса антибиотики при крупно- Замороженная кудыура ( — 5 мя) Рис. 16.6. Схематическое представление промышленного синтеза белка А()<)ва!. В скобках указан обьем культураяьпой орели па каждом этапе. Ня ее полк~ приходится от 60 до 75% обьемд с<хпветстяукяпих биорсакторов (ферментеров). маспп абном культивировании в среду нс добавляют.) Как только плопюсть культуры в биорсакторс на 6<Н) л постигала примерно 4 г/л, температуру повышали с 30 ло 40 'С, чтобы инлуцировать экспрессию гена белка АЦ))(а!.
На повышение гсмпературы в этих условиях уходило около часа. Индукцию проводили прп 40, а не при 42 С, по- ЗБЗ Промышленный синтез белков при участии рскомбипяптных микроорганизмов Сбор клеток уаблаиа 1б.1. Синтез рскомбмнянтпого белка, одним из компонентов которого являюся пепчил инсулина В, при периодической фермснтяпии и при периодической ферысптации с добавлением субстр па' 21 Выход Конечный ооясоятвль веряодячвсяяя фврмвоордяьоя + Тгр явряодячввявя фврмввояяяя с добавлением вубвчрятд явряодячвовдя фврмвьояяяя б,7 0,17 Зб 20 11 1.21 90 12 7,9 0,53 62 Биомасса, г1л Содержание рвкомбмпямчмого болях, % Обьчее колмчоство рвхомбяяянчного белка, г/л ДОЛЯ КЛЕТОК, НВВУД1ИХ ОЛЯЗММДЫ, Уо " По донным робо|о Ооыоо о! в1., Аррг. Моголь!. В!о!о Вло1, 39: 541 — 546, 1993.
11 кодл'могло биомассы ввморвочов в грвммах оулооо вомоочяв яв ливр дульчурьь нрояодурь о11оооодвчоохол формончво1ив о торо омочвво оо к «ультуро лобов чово О 1 г тривуоромв. 11ри ворводвчоокой Омрмоятвявв о лобввчояяоь~ оубочро го в среду добовл во в О 1 о тряотофвмо ковдьв 2 ч ь, оагвоо сложвоотв гво рвч в течение 10 ч Прв лобовломоя больыого колычооовч зрмогоофвмв «о уоолвчмяывсь вв биомасса, мв кодячоо~во омвтодвроовввооо бочвв. скольку при более низкой температуре синтсзировалось такое жс количество белка АЦ)йа!, но клетки могли расти в течение более Длительного периода.
Ишями словами, при более низкой темперачуре индукции (40 "С) выход белкового 11ролукта был больше. Удельная активность белка АЦ)йа! в течение 2 ч после начала индукции повыпчалась, а затем снижалась. Возможно, это бьцю связано с спите:юм протеаз клетками, пере!певшими в фазу замедленного роста или в стационарную фазу. Кроме того, примерна 50% клеток, росших в течение 4 ч 11ри 40 'С, утратилн плазмиду. Но лаже при этом после 4-часового кульгивирования при 40 'С на долю АСь))ка1-белка приходилось примерно 20% всей массы сухого вещества. учитывая все это, можно нс интегрировать гены белка АС))Ба1 и рспрсссора с1 в хромосомную ДНК хозяйской клетки Е. сой с целью увеличения выхода продуктов. Г1ериаг)ическая г)чермептсгч(ия и периодическая фермеитсгция е дабаалепием субсгпраша В некоторых случаях лля достижения высокой плотности культуры и получения болыпих количеств прояукта Достаточно провалить фсрментацию в обычном периодическом режиме.
В одном из экспериментов плачмилу, несущую ген гибридного белка, олним из компонентов которою был псптил инсулина В, помещали пол контроль пр-промотора Е. са11 и вводили в ир— штамм Е. сг111; трансформированные клетки культивировали в срслс с разным содержанием триптофана. При высоких концентрациях последне!о гибридный белок це сиптсзировался; послслуюшее поглощение триптофана из среды растущими клетками приволило к индукции синтеза необходимою белка.
Добавление триптофана в среду при1юлило к увеличению количества как биомассы, так и синтсзирусмого белка, а ис! юльзованис периоличсских ферме нтсров с Добавлением постоянного количества субстрата еще более усиливало э!от эффект (табл. 1б. 1). Чюбы очистить продукт ферментации, нужно прежде всего отделить клетки от культуральной среды. Сбор генетически молифицирова1 гных и исходных, нетрапсформированпых клеток можно провояить одними и теми жс методами.
Однако трансформированные клетки часто облалают другими физиологическими свойствами (о! 1и имеют другой размер или синтезируют внеклсточные полисахарилы), и в результате условия, опчимальные лля сбора петрансформированных клеток, могут нс подхолить Лля клочок, синтезирующих чужеролный белок. Для выделения клеток из болыпих объемов кульгуральной срслы часто используют высокоскоростное центрифугирование. Для этого сконструированы спепиальные высокоскоростные центрифуги полупепрсрывного действия. Суспензию клеток непрерывно пола!от в барабан работающей центрифуги, клетки концеуг1- 364 !ВАВА !б Клеточная суспензия Клетки Мембрана Клетки Клеточная суспензия оппентрнровеннал спензия Кип туряльная среда, не содержащая клеток рируются в нем, а осветленная среда улаляется.
Котла барабан заполняется осажденными клетками, центрифу!у останавливают и клетки собирают. Основное неулобство данного способа— необхолимость останавливать процесс, а затем снова начинать опт. Кроме того, непостатками являются высокая стоимость оборупования и потребляемой им энергии, вероятность утечки микроорганизмов в окружающую среду, невозможность полного улаления клеток из среды. Осве1неннея культурельпяя среда Альтернативный метол выделения клеток из культуральной среды — фильтрация через мембрану.
К сожалению, при обычной филюрации клетки со временем забивают поры мембранного фильтра, накапливаются на его поверхности, н в результате скорость процесса быстро снижается !рис. 1б.7„Л). Фильтрацию можно ускорить, провопя ес пол лавленисм, но это лишь временный эффект; клетки все равно будут накапливаться на поверхности мембраны, а кроме Рис. 1б.т. Способы Фильтрации, применяющиеся Лля сбора клеток. Л. Фильтрация с необратимым забиванием фильтра. Б. Фильтрапия с параллельным потоком клеточной суспензии.
Стрелки — направление потока. Промышленный синтез белков при участии рекомбннантных микроорганизмов 365 того, под давлением они образуют более плотный и менее проницасмый слой. Чтобы решить эту»роблему, клеточную суспензию пропускают с высокой скоростью параллельно поверхности мембраны (рис. 16.7, б), так что через мембрану за олин раунд проходит только небольшая часть циркулирующей жидкости. Остальная сс часть очигцает мембрану от накопившихся клеток (см. рисунок), и в результате скорость фильтрации падает нс так быстро, как при необратимом забиванпи фильтра.
После многочисленных раундов фильтрации через мембрану прохолит почти вся культурш>ьпая среда. Зтот метод используется пока только в лаборатории; в промышленных процессах для сбора клеток прил>сияют пснтрифугированис. Дальнейшие лействия зависят от природы и локализации продукта. Если продукт представляет собой белок, нахалящийся в культуральной среде, то среду концентрируют, а белок очипга>от крал>ота>рафичсскими или другимн методами.
Если продукт — .>то низкомолскулярнос соединение, находящееся в культуральной среде, и> использукп соответствующие методы экстракции. Наконец„сели продукт имеет внугриклетачную локализацию, то прежде чем очищать его, клетки разрушакп. Разрушение клеток Для разрушения клеток используют разнообразные химические, биологические и физические методы. Все про>гедуры лолжны быть даста точно жестки ми, чтобы разрушить кчсточпую стенку„и в тоже время дастагочно мягкими, чтобы исключить денатурацию белка.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
