Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 115
Текст из файла (страница 115)
М., Е. 1>. %о)Г, К. %и, Л. С. ВааГогд. 1987. Н>дЬ-че1осйу ппсгорго!есгйев 1ог де!)чег(пд ппс!его асЫв нио й> щд се1!к. Йа»иге (Еопс)оп) 327: 70-73. Кгйдег-ЕеЬов В., 1. Ро(гу(гив. 1987. А в)шр1е а»>г) е(йс)еп! шегйод Гог Гйгесг депе Нападет !о Ре»ища 1»у»>г»а>»а >ч)(Ьои! е1ес1горогагюп. Рйт» Ма1. В>о». Вер. 5: 289 — 294.
Мйк! В. Е., Р. Е. Гойет(, Р. Л. СЬагевг, Ч. )ч(. 1уег. 1993. РгосеЖгев 1ог Ь>|годг>сй>д 1огегдп Е>(>»А шго р!ап1к, р. 67 — 88. 1п В. К. С>1)с)», Л. Е. ТЪошрвоп (ег).), Ме!»>оВг т Р»ап» Ма»еги!а>. В»о1оду и»>»» В»а»есйпа»оду. СКС Ргевк, Воса Кагоп, Ейь 383 ГГ!ЛВЛ 17 М1!впйага 1., М. 3)да!с!, Н. 1йгосй3са, М. ОЬвЫва, Т. Мпгайав1, У.
Оо!ОЬ, У. Ка1ауове, Я. 3л)а3саввга, К Нов!сага, Я. 3х'!вйв1уа, К. Сепо, А. МосЬГапЫ, Н. Тапппо!о, Н. Твпдаиа, У. ОсвпЫ, У. ОЬав1п. !996. ЕГГ!с!Сп! ргопюгег савве!!ев Гог епйапсес3 ехргеввюп о1' Гоге!дп денев ш с3!Со!у1сс3опопв апс3 пюпосогу1ес3опопв р1аппк Р)ип) Сей Р)с!в)о). 37: 49--59. Ои Гг. УГ., К. У.
Ч'оос3, М. 33С3,пса, Л. К. с3е %ег, 33. К. НейпвЫ, 8. Н. 31оией. 1986. Тгапгйеп! апс3 глайе ехргеввюп ОГ Гйс йгсйу 1пс!Гсгаве депе ш р!ап! се!В апс3 !гапвдеп1с р1аппь Бс)епсе 234! 856-859. Равейоив3с! Л., М. Вапг„А. Водпс3с1, 1. Ро!гу3спв. 1988. СЛепе !агдесшд ш р!апбь Е)!ГВС) Х 7: 4021-4026. РапЫ К. Р. 1995. Р!ап! Ью!ссйпо!оду 1ог стор !шрготептеп!. В)о1ес)!по). Ааск 13! 673 — 693. РО1гу3спв 3.
1990. С!епе !гапвГег !о сегеа!ж ап аввсшшеп!. В1о/Тегбпо!оду 8: 535 — 542. Ро!ту!сов 3. !991. Оепс ггапвГег!о р1аппе аввевыпеп! оГ рпйвйес3 арргоасйев апс3 гевп1!в. Аппи. Веа. Р1ап) Р)сув)о). 42: 205 — 225. ВоЫЬда!е Е. М., М. К. 33агеу, Л. В. Роиег, К. Магсйап!. ! 995. Гас!огв ау!ее!пзь Гйе дспейс спд!пееппд оГ р!ап!в Ьу ппсгорго!есй1е ЬогпЬагйпеп!. В)огас)!по). Ас)к 13! 631 — 65 !. Увп Р., Л. с3е Впувег, У.
Вш Тгапд, К. На!пег, У. Непгу. !995. Росе!дп с)е!!хегу ш1о пюпосогу!ос!опоив врескв, В)о)есбпо). Ас)к 13*. 653 — 671. %а14еп К,,1. ЯЬей. !990. Тесйп!с)пев ш р1ап! шо1есп!аг йо1оду — ргодгевв апс3 ргойсшв. Еиг. Х В)ос)сет. 192: 563-576. %аЫеп К, К. УУЬсдепс3ег. !995. С!Спс-!гапМег апс1 р!апг-гедспега!юп !Ссйп!с)пев. Тгепг)г В!о)ее)особ 13: 324 — 331. Уодег Л. 1., А. Р. Со!двбгопдЬ. 1994. ТгапвГоппабоп вув!Сгп 1ог депега!1пд шаг1сег-1гсе 1гапвдешс р!апш. В)ог' Тес)спо)оду 12: 263 — 267. 7ашйгув3с1 Р. 1988.
Ваяс ргосеввев ппс3ег!у!пд Адгобасгег)ит-гпегйа!ес! ЫЧЛ !савв!ег !о р!аш се!!в. Аппи. Век Пепе). 22: 1 — 30. ХавбгувИ Р., Л. Теп3ре, Л. ЯСЬей. 1989. Тгапвдсг апс! Гипс!юп оГ Т-ГЭ3л)А денев Ггош Адгобасгег)ип! Т! апс1 ГН р!авп!Ил !и р1апбк Сед 56: 193-20!. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Почему Тс-плазмида из Асппбасгепит )итеГас)епв подходит для создания вектора — переносчика чужеродного гена в хромосолшую ДНК растения? 2.
Чем различаются бинарная и коинтегративная векторные системы? 3. Что такое репортерные гены и как они используются при трансформации растительных клеток? 4. В чем заключается метод бомбардировки клеток микрочастицами, использующийся для трансформации растений? 5.
Подробно опишите, как вы будете выделять растительный промспор, специфичный для тканей корней. 6. Как интегрировать чужеродный сен в ДНК хлоро! щастов? 7. Как получить трансгсннос растение, нс содержащее маркерного гена? 8. Как нОВысить активпОсть раститсльесОГО промотора? ГЛЛВА 18 Генная инженерия растений: применение Основной цельк> биотехнологических экспериментов на растениях является создание новых сортов кульзурных растений. Большинство ранних исследований было направлено ца получение высокоурожайных сортов растений без изменения их пищевой ценности. В растения вводили гены, обеспечивающие их устойчивость к насекомым-вредителям, вирусам, гсрбицндам, неблагоприятным условиям окружакы д>ей среды, и гены, замедляющие старение.
Часть этих работ мы рассмотрим пижс. Кроме того, проводились эксперименты по изменению окраски цветов и качества растительных продуктов, а также по использованию растений в качестве »биореакторов». Выведение растений, устойчивых к насекомым-вредителям, вирусам и гербицидам Растения, устойчивые к насекомым-вредителям Если бы хлебныс злаки можно было изменять методами генной инженерии так, чтобы они продуцировали функциональныс инсектициды, то мы получили бы культуры, устойчивые к насекомым-врелителял~ и не требующие опрыскивания дорогостоящими и опасными химическими пестицидами (зачастую такое опрыскивание приходится проволить от шести ло восьми раз в течение вегетационного периода).
1)о оценкам, в 1995 г. на химические инсектициды во всем мире было израсходовано примерно 4 млрд. долларов. Отсюда след>ст, что себестоимость зерна при возделывании культур, устойчивых к насекомым-вредителям, была бы ниже, чем для неустойчивых. Кроме того, биологические инссктициды обы шо действуют лишь на строго ограниченное число видов насекомых и безопасны для человека и других высших животных. Для созлания растений, >стойчивых к насекомым-вредителям, с помощью гснноинжснерных методов были разработаны различные стратегии.
В одном слу ~ас использовали ген инсектицидного протоксина, продуцируемого одним из подвилов Ваейиз гйиплреат (гл. 15). В другом — гены растительных белков типа ингибиторов ал>илазы или протеиназ, эффективных в отношении широкого круга насекомых. Насекомое, в организм которого попадал один из этих ин~ибиторов, было нс способно переваривать растительную пищу, потому по иш ибиторы препятствовали гидролизу крахмала или растительных белков. Протоксин В.
Гйиг1лл)елз1з — это безопасное средство зашиты растений: попадая в окружающую срслу, он теряет активность. К сожалению, множество вредителей хлебных злаков пита|отса внугрснними тканямн растения, так что препараты В. гйиг)пХ)енгн, распыляемые на повсрхносп растений, оказываются мшюэффсктивными. Эту проблему можно рен1ить, если обеспечить экспрессию генов токсинов в самих растениях. гаспылять инсектицнды в этом случае не потребуется и токсины не попадут в окружакпцую среду, а кроме того, не возникнет проблем, связанных с ограничением времени их действия в результате разложения.
Задача биотсхнологов состоит в создании трансгенного растения, которое синтезировало бы активную форму бактсрнального инсектицида в количестве, достаточном для защиты растения от вреди- 390 ГЛАВ)з ! 8 Таблица 18. 1. Экспрессия некоторых ! сноп, кодирующих инссктициды Вас!!!иг !Лиг!ае!еаз!з, п трансгснш )х растениях" ') Экспрессии, % устойчивость к насекомым Растение Гон 03ИИ)1 — 0,0005 0.003-.0.0 ! 2 Нс опрслслястса 0,(Ю125 <0,014 0,000! (О,(Ю2 0,05 — 0,1 0,002 0,002 — 0,2 0,3 у!А(б), полн. сгу!Л(б), укороч. сгу!А(а), полн.
сгу1А(а), укороч. сгу!А('г), укороч. ггу!А(Ь), укороч. агу!А(Ь), укороч., УУ! сту!А(ЕВ укороч., РМ сгу!А(б), укороч., УУ ! сог!А(б), укороч., РМ ат!А(б), укороч., РМ Табак Табак '!'абак Табак Табак Томат Хлопок Хлопок Томат. табак Тол)ат, табак Томат, табак Нот Да Нот Да Да Да Нот Да Да Да Да ') 1!олзниын работы е)у, р. !О5 124, и епгивпс с! з! (са), лага!га г)зпгггяугнчз, ап епымпгпсаса! Вилис!гс!ас: тьсогу зла Рмсасс, 1993 " Обозззачспия.
пояи, — полно!измята зыа гсн г!рсгггзксизза; укороч. — уяпрочсззвял версия гена прогоксина, 5У! — колоны зикого типа; РМ вЂ” 'гагзично измснсиимг попоны; ЕМ - ползззильнз измснгниы» ксаоиы. толя. Гены оу(А(а), с)у/А(/)) н сгу)А(с), ответственныс за синтез инсектицилных белков В. !/!иг!пх!еат ьхр. /сигу!а/с!, практически нс экспрессируются в растениях (табл. 18.1), а для выведения представляющих коммерческий интерес жизнеспособных растений, устойчивых к насекомым-вредителям, необходимо.
чтобы эти белки синтсзировались в большом количестве. Пытаясь решить эту проблему, уменьшили размер встроенного гена так, чтобы сиптезировалась только (з(-концевая часть молекулы токсина, и снаблили его сильным растительным цромотором, чтобы повысить уровень экспрессии. Количество синтезируемого токсина при этом з)ичительно увеличилось, и трансгенш)е растения получили некоторую защиту от насекомых-врепитслсй. Далее была поставлена задача !ийти минимальную длину нуклеотилиной цослеповательности, обеспечивающей активность токсина. Чтобы определит)н сеть ли у разных токсинов одинаковый доа(сн, сравнили аминокислотные последовательности цротоксинов, прояуцируемых разлизп(ыми штаммами В. !/)(сг!пл/еалсс.
Оказалос)н что (з)-концевой участок молекул нротоксинов разных штаммов В. !/!иг(айсепт хзр. /сигу!а/с/ высококонсервативен (гомологня 98%), а С-концевой более вариабелен (гомология 45%). Дальнейшие исследования показали, что вся инсектииидная активность токсина обеспечивается первыми 64б Х-концевыми аминокис- потными остатками молекулы протоксина, общая длина которой составляет 115б аминокислот. Участок гена протоксина, кодирукяций высоко- консервативную ал(инокислотную послсяоватсль„клонировали, зкспрессировали в бактериях и обнаружили, что в отношении защиты растений от насекомых огр)ща чсшускрылых в лабораторных условиях укороченный белок столь же эффективен, как и его нативная форма. Для всестороннего изучения способности укороченного гена 1!ротоксина обеспечивать защиту растений от различных насекомых-вредителей были в(*!ведец)*1 траисгснные растения томата. Укороченный ген, снабженный сильным конститутивным 358-промотором вируса мозаики цветной капусты и сайтом терлсинации транскрипции!полиадснилирования гена нопалинсинтазы, клошсровали в Т-ДНК коинте)'ративного Т!-плазмилного вектора (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
